Единое окно доступа к образовательным ресурсам

Биоэлектрические явления: биоэлектрогенез у растений. Раздел большого практикума по биофизике: Учебно-методическое пособие

Голосов: 0

В пособии представлены методические разработки к разделу "Биофизики" - "Биоэлектрические явления", которые кратко излагают теоретические основы биоэлектрогенеза в растениях и включают лабораторные работы большого практикума по этому разделу. Учебно-методическое пособие предназначено для студентов старших курсов биологического факультета ННГУ, обучающихся по направлению 020200 "Биология" и специальности 020207 "Биофизика".

Приведенный ниже текст получен путем автоматического извлечения из оригинального PDF-документа и предназначен для предварительного просмотра.
Изображения (картинки, формулы, графики) отсутствуют.
    МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ
                 ФЕДЕРАЦИИ
  Федеральное бюджетное государственное образовательное учре-
        ждение высшего профессионального образования
      «Нижегородский государственный университет имени
                     Н.И. Лобачевского»




Сухов В.С., Неруш В.Н., Калинин В.А., Крауз В.О., Воденеев В.А.


       БИОЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ ЯВЛЕНИЯ:
       БИОЭЛЕКТРОГЕНЕЗ У РАСТЕНИЙ

      Раздел большого практикума по биофизике

                Учебно-методическое пособие


 Рекомендовано методической комиссией биологического факульте-
 та для студентов биологического факультета ННГУ, обучающихся
 по направлению 020200 «Биология» и специальности 020207 «Био-
                             физика»




                       Нижний Новгород
                            2011


  УДК 577.3
  ББК 28.07

   Сухов В.С., Неруш В.Н., Калинин В.А., Крауз В.О., Воденеев
В.А., Биоэлектрические явления: биоэлектрогенез у растений.
Раздел большого практикума по биофизике: Учебно-
методическое пособие. – Нижний Новгород: Издательство Ни-
жегородского госуниверситета, 2009. – 69 с.


  Рецензент:    д.ф.-м.н. В.Б. Казанцев




      В настоящем пособии представлены методические разра-
ботки к разделу «Биофизики» - «Биоэлектрические явления», ко-
торые кратко излагают теоретические основы биоэлектрогенеза в
растениях и включают лабораторные работы большого практи-
кума по этому разделу.
      Учебно-методическое пособие предназначено для студен-
тов старших курсов биологического факультета ННГУ, обучаю-
щихся по направлению 020200 «Биология» и специальности
020207 «Биофизика»




                                             УДК 577.3
                                             ББК 28.07

                  © Нижегородский государственный
                    университет им. Н.И. Лобачевского, 2011




                                                                2


                           ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение                                                        4
Глава 1. Потенциалы покоя у растений                            5
Лабораторная работа №1. Изучение потенциала покоя изолиро-
       ванных растительных клеток (харовых водорослей)          12
Лабораторная работа №2. Исследование биоэлектрических по-
       тенциалов высших растений методом экстраклеточной
       регистрации                                              15
Лабораторная работа №3. Изучение фотоэлектрической реакции
       растений                                                 17
Лабораторная работа №4. Внутриклеточная регистрация био-
       электрической активности растений                        20
Глава 2. Потенциалы возбуждения у растений                      23
Лабораторная работа №1. Исследование генерации и распростра-
       нения потенциалов действия у высших растений             30
Лабораторная работа №2. Исследование генерации и распростра-
       нения вариабельных потенциалов у высших растений         32
Лабораторная работа №3. Исследование ионных механизмов гене-
       рации потенциала действия потенциометрическим мето-
       дом                                                      33
Глава 3. Функциональная роль потенциалов возбуждения у рас-
       тений                                                    37
Лабораторная работа №1. Исследование влияния распространя-
       ющихся электрических сигналов на фотосинтетическую
       активность высших растений                               42
Лабораторная работа №2. Исследование влияния распространя-
       ющихся электрических сигналов на холодоустойчивость
       высших растений                                          47
Глава 4. Математическое моделирование процессов биоэлек-
      трогенеза у растений                                      50
Лабораторная работа №1. Теоретический анализ роли систем ак-
      тивного и пассивного транспорта ионов через плазмалемму
      в формировании потенциала покоя и генерации потенциа-
      лов действия у растений                                   63
Лабораторная работа №2. Теоретический анализ процесса рас-
      пространения потенциала действия у высших растений        65

Список рекомендованной литературы                               66




                                                                     3


      Введение
      Биоэлектрогенез, т.е. способность к генерации электрических потенци-
алов, является универсальным свойством всех живых организмов, включая
растения. При этом биоэлектрические процессы не только являются резуль-
татом жизнедеятельности клеток, но и сами играют важную роль в функцио-
нировании живых систем, играя регуляторную, энергетическую, информаци-
онную и другие роли. Кроме того, биоэлектрические потенциалы могут слу-
жить весьма чувствительным диагностическим показателем функционально-
го состояния живого организма, позволяющим, в частности, оценить влияние
на него факторов окружающей среды.
      Процессы биоэлектрогенеза связаны в первую очередь с наличием в
клетках избирательно проницаемых для ионов мембранных структур, в част-
ности – плазматической мембраны (ПМ). Именно потенциалы на ПМ (точнее
трансмембранные разности электрических потенциалов между водными фа-
зами, разделенными ПМ) и связанные с ними показатели (например, разность
потенциалов между различными частями живого объекта) являются одними
из наиболее традиционных объектов при исследованиях биоэлектрогенеза. В
то же время, генерация электрических потенциалов может происходить и на
других мембранных структурах клетки, в первую очередь – на сопрягающих
мембранах (тилакоидные мембраны хлоропластов и мембраны митохон-
дрий), разность электрических потенциалов которых участвует в синтезе
АТФ.
      Среди потенциалов ПМ могут быть выделены стационарные потенциа-
лы и потенциалы возбуждения. К стационарным потенциалам относят посто-
янные или относительно медленно меняющиеся во времени потенциалы на
ПМ. Так можно отметить потенциалы покоя (ПП) (трансмембранная разность
потенциалов на ПМ в условиях покоя) и обусловленные ими потенциалы –
метаболические потенциалы (разности потенциалов связанные с разной ин-
тенсивностью метаболизма в различных участках растения, например между
освещенным и неосвещенным участками - фотоэлектрическая реакция), де-
маркационные потенциалы (между интактным и поврежденным участками) и
др.
      Потенциалы возбуждения представляют собой быстрые и обратимые
изменения мембранного потенциала, вызванные обычно действием тех или
иных факторов. К потенциалам возбуждения относятся в первую очередь по-
тенциалы действия (ПД), наблюдающиеся как у животных (нервные и мы-
шечные клетки), так и у растений. У растительных объектов наблюдается
еще один специфический тип потенциалов возбуждения – вариабельные по-
тенциалы (ВП), отличающиеся по ряду параметров от потенциалов действия.
      Следует отметить, что разделение на стационарные потенциалы и по-
тенциалы возбуждения не имеет абсолютного характера. Так, например, раз-
ность потенциалов между освещенным и не освещенным участками листа
является, безусловно, метаболическим потенциалом, однако фотоэлектрич-
                                                                        4


ская реакция, возникающая в ответ на освещение листа, имеет черты потен-
циала возбуждения – возникает в ответ на действие внешнего фактора (свет)
и имеет сложную, колебательную кинетику. Учитывая относительно мед-
ленный характер изменений потенциала в ходе фотоэлектрической реакции
(~мин и более), в рамках настоящей работы она будет рассматриваться как
стационарный потенциал.
      Кроме стационарных потенциалов и потенциалов возбуждения можно
выделить еще одну группу биоэлектрических процессов – это осцилляции
мембранного потенциала. Такие автоколебательные процессы не являются
стационарными потенциалами, так как мембранный потенциал быстро и
непрерывно меняет свою величину, однако их нельзя отнести и к потенциа-
лам возбуждения, так как отсутствуют факторы, индуцирующие колебания.
В качестве примера осцилляций потенциала ПМ у растений можно привести
микроритмы – быстрые (частота ~ нескольких герц) и низкоамплитудные
(менее 1 мВ) колебания мембранного потенциала в клетках растений.
      В целом следует отметить, что если у животных процессы биоэлектро-
генеза изучены достаточно полно, то у растений эта проблема находиться в
стадии активного изучения. При этом наиболее изученными остаются био-
электрические процессы в клетках харовых водорослей, которые являются
наиболее традиционным объектом исследования в электрофизиологии расте-
ний. Однако такие клетки являются значительно упрощенной системой по
сравнению со сложными комплексами связанных клеток, которые характер-
ны для высших растений, что делает проблему исследования биоэлектроге-
неза у последних весьма важным направлением исследований. Поэтому изу-
чение биоэлектрических свойств многоклеточных высших растений и освое-
ние методических приемов таких исследований, наряду с освоением класси-
ческих методов изучения биоэлектрогенеза харовых водорослей является ос-
новной задачей данного практикума.

     ГЛАВА 1. ПОТЕНЦИАЛ ПОКОЯ У РАСТЕНИЙ

      Как уже отмечалось, к стационарным потенциалам относят постоянные
или относительно медленно меняющиеся во времени потенциалы на ПМ.
Ключевая роль при этом принадлежит ПП – т.е. трансмембранной разности
потенциалом на ПМ в покое. Именно существование ПП обеспечивает раз-
ность потенциалов между поврежденным и неповрежденным участками рас-
тительного организма при возникновении демаркационного потенциала, а
разность между ПП (и как следствие – между поверхностными потенциала-
ми) в зонах растения с различной интенсивностью метаболизма обеспечивает
возникновение метаболических потенциалов. Изменения ПП, связанные с
протекающими внутри клетки процессами, могут приводить к появлению
медленно меняющихся стационарных потенциалов, например, к фотоэлек-
трической реакции.
      ПП (Em) у растений, как, впрочем, и у животных, включает в себя две
компоненты – диффузионную (пассивную) и метаболическую (активную,
                                                                        5


насосную), в то же время, если у животных вкладом активной компоненты
можно, как правило, пренебречь (менее 2%), то у растений она значительно
выше (60-70%).

     Диффузионная компонента ПП
     Диффузионная компонента ПП (ED) – может быть рассчитана по урав-
нению Гольдмана, учитывающему активность (aj,k) потенциалопределяющих
ионов внутри (i) и снаружи (o) клетки:
           RT
                  Pj  a j  o   Pk  ak  i
      ED 
                 j                  k

           zF  Pj  a j  i   Pk  a k  o
              ln                                    ,                 (1.1)
                     j                k

где R – универсальная газовая постоянная, Т – абсолютная температура (в К),
F – постоянная Фарадея, z – усредненная валентность, Pj+ – проницаемость
ПМ для катиона j, Pk- – проницаемость ПМ для аниона k.
      В реальных условиях обычно учитываются только три типа ионов K+,
Cl- и Na+ и уравнение (1.1) преобразуется в (1.2):
      ED 
                                   
             RT PK K  o  PNa Na  o  PCl Cl  i  
             F
               ln
                                               
                  PK K  i  PNa Na  i  PCl Cl  o
                                                     ,                (1.2)
где PK, PNa и PCl – проницаемости для K+, Na+ и Cl-, соответственно.
      Если принять во внимание, что проницаемость ПМ для ионов калия
обычно существенно выше, чем для других потенциалобразующих ионов, то
можно описать диффузионную компоненту уравнением Нернста для К+ (ED –
близок к калиевому равновесному потенциалу):
      ED 
             RT   K 
                     
                          o
                ln           ,                                       (1.3)
             F    K       i

      Учитывая тот факт, что концентрация калия внутри клетки, обычно,
значительно (на 2-3 порядка) выше, чем его концентрация во внешней среде,
ED имеет отрицательную величину.
      Однако следует отметить, что уравнения (1.1) – (1.3) могут быть ис-
пользованы для оценки величины ED в условиях подавленной метаболиче-
ской компоненты (или когда она пренебрежимо мала, как, например, в нерв-
ных клетках животных). В том же случае, когда в ПП одновременно присут-
ствует достаточно значительная метаболическая компонента, для учета ED
требуются более сложные подходы, которые мы рассмотрим чуть ниже.
      До сих пор мы говорили о пассивной проницаемости ПМ, не касаясь
вопроса об ее механизмах. Однако, учитывая тот факт, что проницаемость
липидного бислоя, лежащего в основе биомембран, для ионов очень низка,
высокая проницаемость ПМ для потенциалобразующих ионов должна быть
связана со специальными структурами на мембране. Такими структурами яв-
ляются основные системы пассивного транспорта для ионов – ионные кана-
лы.
      Ионные каналы представляют собой белковую структуру, состоящую
из следующих частей: части интегрального белка, образующего пору в мем-
бране, воротного механизма, селективного фильтра (центра) и сенсора, вос-
                                                                          6


принимающего внешние сигналы. Пора делает возможным собственно дви-
жение иона через мембрану, селективный фильтр отвечает за высокую спе-
цифичность проведения у ионных каналов, воротный механизм и сенсор
обеспечивают регуляцию канала, его управляемость.

      Метаболическая компонента ПП
      Метаболическая составляющая ПП (EP) – возникает в результате рабо-
ты электрогенного насоса, роль которого в ПМ растений играет Н+-АТФаза.
Доля метаболического компонента в ПП у растительных объектов может до-
стигать 60-70% от общего Em, что обеспечивает высокие значения ПП у рас-
тений (около -150 мВ, у некоторых водных растений он может быть отрица-
тельнее -250 мВ).
      Н+-АТФаза является АТФазой типа E1E2, функционирование которых
связано с переходами между двумя конформационными состояниями фер-
мента (E1 и E2), различающимися по своему сродству к АТФ и Н+. Активный
центр располагается с внутренней стороны ПМ, выделяющаяся в ходе гидро-
лиза АТФ энергия расходуется на перенос Н+ через мембрану против элек-
трохимического градиента.
      На одну молекулу АТФ, в зависимости от условий, может, по-
видимому, переноситься как 1 так и 2 протона. Общая скорость переноса
протонов составляет 105-106 Н+ в секунду, а концентрация молекул фермента
составляет около 104 на мкм2. Высокая концентрация и активность Н+-
АТФазы обеспечивает высокий поток протонов и – в конечном итоге - значи-
тельную величину метаболической компоненты. Следует также отметить, что
помимо высокого электрического градиента, Н+-АТФаза создает на ПМ зна-
чительный химический градиент протонов, который играет существенную
роль во вторичном транспорте на мембране.

      Взаимодействие диффузионной и метаболической компонент ПП
      Существование двух компонент ПП с разной природой делает актуаль-
ным вопрос об их взаимодействии, которое является достаточно сложным
процессом. Так, например, высокий электрический градиент на мембране, со-
зданный за счет функционирования Н+-АТФазы (т.е. за счет метаболической
компоненты) способствует поступлению в клетку ионов калия, тем самым
повышая [К+]i и снижая [К+]o, т.е. увеличивая абсолютную величину ED. С
другой стороны, создаваемые протонной помпой градиенты Н+ также могут
путем симпорта или антипорта с потенциалобразующим ионами влиять на их
распределение, а значит – менять диффузионную компоненту.
      Однако, даже рассматривая только электрическое взаимодействие
между активной и пассивной компонентами Em, мы не можем принимать ПП
как алгебраическую их сумму, так как вклады каждой из составляющих в
итоговый потенциал могут быть различными. Попробуем их рассчитать.
      На основе уравнений Ходжкина-Хаксли в модели потенциала действия
в нерве, изменение Em является функцией суммы токов, текущих через мем-
брану:
                                                                        7


      dE m 1
           i j ,                                                                      (1.4)
       dt  c j
где c – удельная емкость мембраны, ij – токи, участвующие в ПД (обычно
принимается, что это токи ионов натрия и калия; для растений целесообразно
рассмотреть также токи ионов хлора).
      Величина тока (ij) описывается уравнением (1.5):
       i j  g j E j  Em ,                                        (1.5)
где gj – удельная проводимость для иона j, Еj – его равновесный потенциал,
который рассчитывается по уравнению Нернста (для ионов калия это уравне-
ние (1.3)).
      Если представить протонную помпу как источник тока, то ток через Н+-
АТФазу (iPu) можно описать близким уравнением (1.6):
       iPu  g Pu E Pu  Em  ,                                      (1.6)
где gРu – удельная проводимость протонной помпы, ЕРu – ее ЭДС:
             
               G АТФ RT
                     
                           H      
                                   
                                        o
      E Pu               ln                ,                                           (1.7)
                nF     F   H            i

где ΔGАТФ – энергия гидролиза АТФ (~50 кДж/моль), n – число протонов, пе-
реносимых при гидролизе 1 АТФ (примем, что n=1).
     Подставив в (1.4) – (1.5) (для ионов натрия, калия и хлора) и (1.6) и
прировняв (1.4) к 0 (условия стационарности значений – Em не должно ме-
няться) можно легко выразить Em:
              g Pu E Pu  g K E K  g Cl ECl  g Na E Na
      Em                                                .                              (1.8)
                       g Pu  g K  g Cl  g Na
     Уравнение (1.8) позволяет учесть вклад метаболической и диффузион-
ной компонент в итоговый мембранный потенциал. Если записать его в не-
сколько ином виде, то можно получить их в явной форме:

                        g Pu E Pu         g E  g Cl ECl  g Na E Na
      Em                                 K K                        E P ' E D ' ,   (1.9)
              g Pu    g K  g Cl  g Na    g Pu  g K  g Cl  g Na
где EP’ и ED’ – величины метаболического и диффузионного потенциалов при
одновременном наличии и того, и другого.

      Лабильность ПП у растений
      Одной из важных особенностей ПП у растений является его лабиль-
ность, т.е. способность к изменению величины под действием тех или иных
внешних факторов, которая связана, прежде всего, со значительным вкладом
в него активной компоненты, которая зависит от общей интенсивности мета-
болизма в клетке. Реализация такой связи может осуществляться за счет из-
менения энергизации клетки. Так, например, при интенсификации метаболи-
ческих процессов может происходить следующая последовательность собы-
тий: возрастание интенсивности метаболических процессов → повышение
содержания АТФ в клетке → активация Н+-АТФазы, за счет увеличения кон-
центрации ее субстрата → увеличение метаболической компоненты ПП.
Сходная, но противоположено направленная последовательность событий
                                                                                            8


будет происходить при снижении активности метаболических процессов. В
то же время, отметим, что связь между метаболическими процессами и ЕР
может реализовываться и другими путями, в частности, вследствие измене-
ния рН цитоплазмы, которое, с одной стороны, тесно связано с метаболизмом
клетки, а с другой – модулирует активность Н+-АТФазы, так как протоны
также являются ее субстратом.
      Помимо изменений ЕР опосредованных индуцированными действиями
тех или иных факторов на метаболизм растительных клеток, возможна и си-
туация в которой влияние внешнего фактора на ПП реализуется непосред-
ственно путем воздействия на активность протонной помпы. Так, например,
являясь ферментом, Н+-АТФаза очень чувствительна к изменениям темпера-
туры и претерпевает значительную инактивацию при ее снижении. Возмож-
но, что действие температуры при этом опосредуется фазовыми переходами
в липидном матриксе.
      Определенную роль в обеспечении лабильности метаболической ком-
поненты ПП могут играть и регуляторные системы, обеспечивающие регуля-
цию функционирования систем активного транспорта. Примером такой регу-
ляции может служить инактивация Н+-АТФазы под действием ионов каль-
ция.
      Наконец, следует отметить, что связь между индуцированными внеш-
ними факторами изменениями метаболизма клетки и величиной ПП может,
по-видимому, реализовываться и посредством модификации пассивной ком-
поненты ПП. Так, например, показано, что содержание АТФ может суще-
ственно влиять на кинетику инактивации хлорных каналов. Фактором, влия-
ющим на активность канала, может служить и рН. Таким образом, нельзя ис-
ключать, что определенный вклад в обеспечение лабильности ПП, может
вносить и изменчивость ED.
      Рассмотрим в качестве примеров, показывающих лабильность ПП, вли-
яние на него постепенного охлаждения и освещения (фотоэлектрическая ре-
акция).
      При охлаждении наблюдается постепенная деполяризация мембранно-
го потенциала, вплоть до величин близких к значениям диффузионной ком-
поненты ПП. Такая деполяризация может осложняться появлением потенци-
алов возбуждения. Через 10-20 мин после снижения ПП наблюдается частич-
ное восстановление его исходной величины – адаптивная реполяризация.
Отметим, что и деполяризация, и адаптивная реполяризация связаны, по-
видимому, с изменениями активности Н+-АТФазы. При этом деполяризация
обусловлена как прямой инактивацией фермента при охлаждении, так и сни-
жением его активности при фазовом переходе мембранных липидов из жид-
кокристаллического в твердое состояние. Нельзя исключать также, что опре-
деленный вклад в постепенную деполяризацию ПП вносит и инактивация
протонной помпы, вызванная повышением содержания Са2+ в цитоплазме,
так как известно, что механочувствительные кальциевые каналы могут быть
активированы фазовыми переходами в липидном бислое. Механизмы адап-
тивной реполяризации менее изучены, однако весьма вероятной представля-
                                                                        9


ется их связь с адаптивным увеличением доли ненасыщенных жирных кислот
в липидах плазмалеммы и снижение температуры фазового перехода.
      Другим примером лабильности ПП у растений может служить фото-
электрическая реакция – изменения мембранного потенциала, имеющие в
общем случае сложную колебательную кинетику, в которой иногда выделя-
ют следующие фазы: 1-я позитивная волна → 2-я негативная волна → 3-я по-
зитивная волна (при переходе темнота → свет) или 1-я негативная волна →
2-я позитивная волна → 3-я негативная волна (при переходе свет → темнота).
В конечном итоге при переходе темнота → свет величина ПП возрастает, а
при переходе свет → темнота – снижается. С использованием ингибиторов и
различных диапазонов возбуждающего света было показано, что такие изме-
нения связаны с фотосинтетическими процессами. Последнее делает весьма
актуальным вопрос о путях реализации связи между индукционными процес-
сами в фотосинтетическом аппарате и изменениями ПП.
      Опираясь на современные представления об индукционных процессах
в фотосинтетическом аппарате, можно предположить возможную последова-
тельность событий, обеспечивающих переходные процессы при освещении
листа: включение света → начало движения электронов по электронно-
транспортной цепи (ЭТЦ) и реактивация Н+-АТФ-синтазы, которая инакти-
вируется в темноте → перенос протонов из стромы в люмен (за счет функци-
онирования ЭТЦ) и гидролиз стромальной АТФ Н+-АТФ-синтазой, которая
до формирования достаточного электрохимического градиента протонов на
тилакоидной мембране может функционировать как АТФаза → снижение
[H+] и [АТФ] в строме, а затем и в цитоплазме → снижение активности Н+-
АТФазы → деполяризация ПП (формирование 1-й позитивной волны) →
рост электрохимического градиента на тилакоидной мембране → переход
Н+-АТФ-синтазы к синтетазной активности → повышение содержания АТФ
в строме и цитоплазме → активация Н+-АТФазы → реполяризация ПП (фор-
мирование 2-й негативной волны) → реактивация цикла Кальвина, который
инактивируется в темноте → увеличение потребления АТФ → снижение
концентрации АТФ в строме и цитоплазме → деполяризация ПП (формиро-
вание 3-й позитивной волны). Качественно похожая, но реализующаяся в
противоположенном направлении, последовательность событий, вероятно,
имеет место и при обратном переходе: свет → темнота.

      Функциональная роль ПП
      Функциональная роль ПП достаточно многообразна, так можно отме-
тить энергетическую, регуляторную, защитную и другие его функции.
      Роль ПП как энергетического фактора заключается в том, что электри-
ческая форма энергии может расходоваться на протекание тех или иных свя-
занных с мембраной процессов, в первую очередь – транспортных. Так, в
частности, показано, трансмембранный электрический потенциал может
служить движущей силой для функционирования ряда систем вторичного ак-
тивного транспорта (например, переносчика сахарозы в ПМ), при функцио-
нировании которых происходит некомпенсированный перенос ионов или пе-
                                                                        10



    
Яндекс цитирования Яндекс.Метрика