Единое окно доступа к образовательным ресурсам

Перенос нуклеиновых кислот в ткани и клетки (на пути к генной терапии)

Голосов: 1

Статья посвящена описанию существующих способов доставки молекул ДНК в клетки в контексте все возрастающего интереса к генной терапии. Наиболее подробно обсуждается электротрансфекция, то есть перенос ДНК под действием кратковременных импульсов сильного электрического поля.

Приведенный ниже текст получен путем автоматического извлечения из оригинального PDF-документа и предназначен для предварительного просмотра.
Изображения (картинки, формулы, графики) отсутствуют.
                                                                                     БИОЛОГИЯ

                              ПЕРЕНОС НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В ТКАНИ И КЛЕТКИ
                                       (НА ПУТИ К ГЕННОЙ ТЕРАПИИ)

                                                                             Ю. А. ЧИЗМАДЖЕВ
                                                  Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова



                                                                                                          ВВЕДЕНИЕ
                              ON THE WAY TO GENE THERAPY                                                Живая клетка – это многопрофильный завод, кото-
                                                                                                    рый имеет собственные силовые станции (митохонд-
                              Yu. A. CHIZMADZHEV                                                    рии), цеха для производства белков-запчастей (рибосо-
                                                                                                    мы), разветвленную рельсовую сеть (микротрубочки),
                              Some ways of DNA delivery to the cells in the                         по которой молекулы-тягачи (например, кинезин) пе-
                              context of increasing interest to gene therapy                        ревозят необходимые грузы. Работа этого предприятия
                              are described. The main attention is given to                         управляется центральным компьютером (совокупность
                                                                                                    хромосом), который находится в клеточном ядре. Каж-
                              the electrotransfection – DNA transfer under                          дая хромосома содержит множество генов, каждый из
                              influence of the short pulses of the strong elec-                     которых представляет собой особую последователь-
                              tric field.                                                           ность оснований нуклеотидов в молекулах ДНК; имен-
                                                                                                    но здесь сосредоточена генетическая память клетки, а
                              Статья посвящена описанию существую-                                  также закодированы рабочие инструкции. Можно ска-
                                                                                                    зать, что геном клетки – это жесткий диск центрально-
                              щих способов доставки молекул ДНК в
                                                                                                    го компьютера, а носителями оперативной памяти яв-
                              клетки в контексте все возрастающего                                  ляются молекулы РНК, которые организуют синтез
                              интереса к генной терапии. Наиболее по-                               белков, необходимых для нормальной жизни клетки.
                              дробно обсуждается электротрансфекция,                                Если в каком-то гене произойдут изменения – мута-
                              то есть перенос ДНК под действием крат-                               ции, это может отразиться на биосинтезе определенно-
                                                                                                    го белка, в результате чего будет нарушен метаболизм
                              ковременных импульсов сильного электри-                               клетки. В таких случаях говорят о патологиях генетиче-
                              ческого поля.                                                         ского происхождения.
                                                                                                        Уже в середине прошлого века вскоре после фор-
                                                                                                    мулировки центральной догмы молекулярной биоло-
                                                                                                    гии о потоке генетической информации от ДНК к РНК
                                                                                                    и далее к белку в научной литературе появились выска-
                                                                                                    зывания о принципиальной возможности коррекции
                                                                                                    дефектных генов, ответственных за развитие опреде-
                                                                                                    ленных заболеваний. С тех пор, набирая темп, развива-
                                                                                                    ются научные исследования, направленные на созда-
     © Чизмаджев Ю.А., 2004




                                                                                                    ние генной терапии. Специалисты сходятся во мнении,
                                                                                                    что решение этой проблемы будет найдено, но не ра-
                                                                                                    нее, чем через 10–15 лет, так как необходимо преодо-
                                                                                                    леть много серьезных трудностей. При этом речь идет
                                                                                                    об излечении заболеваний, вызванных нарушениями в
                                                                                                    одном гене. К сожалению, многие распространенные
                                                      journal.issep.rssi.ru                         заболевания, такие, как диабет, артриты, болезнь Альц-
                                                                                                    геймера и др., являются результатом мутаций во многих



24                                                    С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 8 , № 2 , 2 0 0 4


                                                             БИОЛОГИЯ
генах. Возможности генной терапии в этих случаях вы-                           на клеточных суспензиях, где была получена высокая
глядят проблематичными.                                                        эффективность трансфекции. Все они неплохо работа-
    Чтобы отремонтировать или заменить дефектный                               ют и на тканевом уровне. К достоинствам физических
ген, используют следующие подходы: 1) в геном допол-                           методов следует отнести то обстоятельство, что они ба-
нительно встраивается нормальный ген, 2) дефектный                             зируются на строгой теории, подтвержденной много-
ген заменяется на нормальный с помощью отработан-                              численными исследованиями. Наряду с физическими
ных генно-инженерных манипуляций, 3) дефектный                                 распространены и химические методы, в рамках кото-
ген пытаются отремонтировать, вызывая селективную                              рых в организм вводится ДНК, защищенная липидами
обратную мутацию, 4) понижается степень активности                             или полимерами, которые заодно способствуют и пре-
дефектного гена. Проведение всех этих “ремонтных                               одолению мембранного барьера. К сожалению, меха-
работ” в клеточном ядре представляет огромные труд-                            низм взаимодействия таких комплексов с мембранами
ности. Интеграция вводимой ДНК в геном – это слож-                             до сих пор не выяснен.
ный и недостаточно изученный процесс. Чтобы полу-                                  На практике наибольшее распространение имеет,
чить стабильный эффект, терапевтическая ДНК должна                             пожалуй, биологический метод трансфекции, который
достаточно долго функционировать в клеткaх. Когда                              основан на использовании вирусов-векторов. Идея ме-
введение ДНК, отвечающей за продукцию необходимо-                              тода проста и изящна, хотя он и таит в себе немалые
го белка, приводит к его экспрессии, говорят об успеш-                         опасности. На собственном опыте мы знаем, насколь-
ной трансфекции. В настоящее время ситуация такова,                            ко успешно вирус гриппа во время очередной эпиде-
что пациенты должны подвергаться многократным се-                              мии атакует наши беззащитные клетки, внедряя в них
ансам генной терапии. Введение в клетки молекул                                свою РНК. Вот эта уникальная способность вирусов
ДНК, или их фрагментов, или других макромолекул,                               “вскрывать сейфы” используется в генной терапии.
играющих роль ремонтного инструмента, – задача,                                Генные инженеры умеют так прооперировать вирус,
прямо скажем, непростая, так как практически любая                             что вместо его собственной ДНК или РНК он получает
клетка окружена мембраной, которая призвана ограж-                             нормальный терапевтический ген. При этом вирус со-
дать клетку от непрошеных гостей. Чтобы справиться с                           храняет способность сливаться с клеткой-мишенью, в
этой трудностью, используются физические, химичес-                             которую он впрыскивает здоровый ген, способный за-
кие и биологические методы, каждый из которых имеет                            менить больной. Все выглядит как в сказке, но happy
определенные достоинства в сочетании с набором не-                             end не гарантирован: появившийся в организме вирус
достатков. Некоторые из этих методов научно обосно-                            потенциально является источником токсичности и не-
ваны, а другие носят эмпирический характер. Мы по-                             предсказуемой иммунной реакции. Более того, вирус-
дробно остановимся на этих вопросах, поскольку                                 вектор в организме пациента может восстановить свою
именно им посвящена данная статья.                                             инфекционность. Поэтому неудивительно, что физи-
                                                                               ческие методы трансфекции приобретают все больше
   МЕТОДЫ ТРАНСФЕКЦИИ                                                          сторонников.
    Казалось бы, проще всего прибегнуть к инъекции
соответствующей плазмиды – внутримышечно или                                         ЭЛЕКТРОТРАНСФЕКЦИЯ
внутривенно и посмотреть, что из этого получится. Та-                               ДНК – это огромная гидрофильная молекула, ко-
кие попытки неоднократно делали в опытах на живот-                             торая несет значительный отрицательный заряд. По-
ных, причем инъекции проводили, как правило, ло-                               этому ее перенос через липидные мембраны, представ-
кально, адресуясь либо к скелетным мышцам, либо к                              ляющие собой высокий гидрофобный барьер, крайне
сердечной мышце или печени. Однако быстрая дегра-                              затруднен. Однако сравнительно простая модифика-
дация ДНК-нуклеазами и активный фагоцитоз не поз-                              ция ДНК различными химическими агентами индуци-
воляли получить требуемый уровень трансфекции.                                 рует трансфекцию клеток млекопитающих (см. обзор
Чтобы радикально повысить его, на практике исполь-                             [1]). Механизм переноса ДНК в подобных случаях, к
зуются три физических метода: ткань обрабатывают                               сожалению, до сих пор не выяснен. Еще эффективнее
либо короткими электрическими импульсами, либо                                 оказывается обработка суспензии клеток электричес-
ультразвуком или, наконец, обстреливают из “генного                            кими импульсами (см. обзор [2]), которая применима в
пистолета”, который заряжен микроскопическими зо-                              равной мере ко всем типам клеток. Универсальность
лотыми пулями, на поверхности которых адсорбиро-                               электротрансфекции обеспечила этому методу широ-
вана ДНК. Эти способы роднит общая идея – все они                              кое распространение. Многочисленные исследования,
обратимо разрушают плазматические мембраны и от-                               проводившиеся во всем мире в течение двух последних
крывают прямой и быстрый доступ ДНК к клеточному                               десятилетий, позволили прояснить интригующий во-
ядру. Первые два из этих методов ранее апробированы                            прос о механизме электроиндуцированного переноса



      Ч И З М А Д Ж Е В Ю . А . П Е Р Е Н О С Н У К Л Е И Н О В Ы Х К И С Л О Т В Т К А Н И И К Л Е Т К И ( Н А П У Т И К Г Е Н Н О Й Т Е РА П И И )   25


                                                               БИОЛОГИЯ
     ДНК через мембраны. Этому способствовало установ-                                     а
     ление корреляции между электротрансфекцией и элек-
     тропорацией мембран, которая была уже досконально
     изучена.

          ЭЛЕКТРОПОРАЦИЯ
          Мы не будем останавливаться на всех перипетиях
     увлекательной истории о выяснении природы воздей-
     ствия электрических полей на мембраны, тем более что
     в какой-то мере они отражены в статьях, опубликован-
     ных ранее в “Соросовском Образовательном Журнале”
     [3, 4]. Ограничимся обсуждением тех вопросов, кото-
     рые имеют принципиальное значение для выяснения
     механизмов переноса ДНК через мембраны.
          В ходе многочисленных исследований установле-
     но, что воздействие на клетки импульсов электричес-
     кого поля высокой напряженности (0,5–15 кВ/см в за-                                   б                                  U = 250 мВ
     висимости от типа клеток) и различной длительности
     импульса (10 мкс – 50 мс) ведет к сильному увеличению                             1,5 нС
     проницаемости плазматической мембраны для малых
     ионов, низко- и высокомолекулярных веществ. Если
     электрическая обработка является слишком интенсив-                                               150 мс
     ной, происходит необратимое разрушение мембран,
     приводящее к гибели клеток. При умеренной обработке                                Рис. 1. а – электронная микрофотография, демон-
                                                                                        стрирующая появление пор в мембране эритроци-
     после некоторого времени релаксации проницаемость                                  та. Их диаметр составляет десятки нанометров; б –
     мембран возвращается к исходному уровню, то есть яв-                               проводимость одиночных пор в липидном бислое,
     ление носит обратимый характер. Основные сведения                                  порожденных электрическим полем
     о механизме воздействия электрического поля на мем-
     браны получены из измерений на бислойных липид-                              кость, εw и εm – диэлектрические постоянные водного
     ных мембранах (БЛМ). В этих опытах была обнаружена                           раствора и материала мембраны соответственно, а U –
     крайне резкая зависимость среднего времени жизни t                           разность потенциалов, приложенная к мембране. Пер-
     бислоев от приложенного потенциала U : при измене-                           вые два члена в формуле (1) вполне очевидны: первый
     нии U от 100 до 600 мВ t изменяется на пять порядков                         учитывает увеличение внутренней энергии при образо-
     величины – от минут до миллисекунд. Были предложе-                           вании кромки поры, а второй – ее уменьшение благо-
     ны два различных механизма электрического пробоя:                            даря уменьшению площади плоской поверхности раз-
     электромеханический и статистический. Согласно пер-                          дела липид–раствор. Третье слагаемое в формуле (1)
     вому, разрушение БЛМ происходит в результате одно-                           представляет особый интерес, так как именно оно опи-
     родной по всей мембране электрострикции, а согласно                          сывает зависимость изменений внутренней энергии от
     второму, оно носит локальный характер и является                             электрического поля. Вспомним популярный школь-
     следствием возникновения и роста пор. Сейчас уже нет                         ный опыт. Представьте, что в воду перпендикулярно к
     сомнений в справедливости второго механизма, так                             границе раздела вода–воздух полупогружены две плос-
     как наличие пор документировано электронной мик-                             кие металлические пластины, образующие конденса-
     роскопией (рис. 1, а) и подтверждено электрической                           тор, частично заполненный водой, частично воздухом
     регистрацией одиночных липидных пор, средний раз-                            (рис. 2, а). Если приложить к пластинам разность потен-
     мер которых составляет 0,5 нм, а время их жизни от 1 до                      циалов, то полярная жидкость в конденсаторе поднима-
     100 мс (рис. 1, б ). Работа ∆W, которую необходимо со-                       ется на определенную высоту, так как это уменьшает
     вершить для образования поры радиуса r в мембране                            электрическую составляющую свободной энергии. Вы-
     записывается в виде                                                          сота поднятия жидкости ограничена ростом гравита-
                                        εw        U
                                                      2                           ционной компоненты свободной энергии и может быть
            ∆W = 2πrγ – πr σ – πr C m  ---- – 1 ----- ,
                          2      2
                                           -          -                 (1)       найдена из условия баланса этих двух компонентов.
                                       εm  2
                                                                                  Теперь вернемся к липидному бислою, который подо-
     где γ – линейное натяжение на кромке поры, σ – натя-                         бен конденсатору с низкой диэлектрической постоян-
     жение мембраны, Cm – ее удельная электрическая ем-                           ной; роль металлических пластин играют растворы



26                                  С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 8 , № 2 , 2 0 0 4


                                                               БИОЛОГИЯ
              а                                       б                          из малых и короткоживущих пор с гидрофобной кром-
                                                                                 кой в ходе реориентации липидных молекул (рис. 2, г).
 Воздух               U    0                 U                                   В модельных бислоях определенного химического со-
                                                              σ
                                                                                 става при умеренной электрообработке удается нако-
                                             εm
                                                                                 пить чрезвычайно большое количество метастабиль-
 Вода                                                         γ
                                           εw                                    ных пор, не приводящих к немедленному разрушению
                                                  r                              мембраны. В этом случае принято говорить об обрати-
                                                                                 мом пробое или обратимой электропорации. Состав
                                                      г                          клеточных мембран таков, что там реализуется как раз
                                                                                 обратимая электропорация, что и делает данный метод
 W        в                                                                      перспективным с точки зрения биотехнологии и ген-
                                                                                 ной терапии.
                               U=0                        r

                                                                                       МЕХАНИЗМ ПЕРЕНОСА ДНК
              U   0                                   д
∆W *                                                                                 Итак, мы знаем, что: 1) электрическое поле способ-
                                                                                 ствует трансфекции, 2) электрическое поле вызывает
                                                          r                      порацию мембран, 3) между порацией и трансфекцией
         r*(U)        r*
                       0              r
                                                                                 имеется корреляция. Поэтому хотелось бы заявить, что
                                                                                 ДНК проникает через мембрану, используя поры, если
     Рис. 2. а – подъем полярной жидкости в плоском                              бы не известные проблемы с верблюдом, который не
     конденсаторе (подробности в тексте); б – линейное                           желает пролезать через игольное ушко. Действительно,
     натяжение γ стремится захлопнуть пору, а натяже-                            несоответствие размеров пор и ДНК носит разитель-
     ние σ способствует ее росту. Действие электричес-
     кого поля эквивалентно повышению σ; в – измене-
                                                                                 ный характер. Электрообработкой удается вводить в
     ние свободной энергии мембраны как функция ра-                              клетки ДНК размерами 150–200 тыс. пар оснований,
     диуса поры имеет колоколообразный вид, что                                  что дает эффективный диаметр статистического клубка
     говорит о метастабильности системы; г – гидрофоб-                           в растворе более 2000 нм. Диаметр двойной спирали
     ная пора является предшественницей гидрофиль-
     ной поры, которая показана на рис. 2, д                                     ДНК 2 нм, а диаметр суперскрученной плазмидной
                                                                                 ДНК несколько больше. Напомним, что средний раз-
электролитов, окружающие бислой (рис. 2, б ). Если                               мер пор составляет примерно 0,5 нм. Эти цифры за-
приложить к бислою электрическое напряжение и об-                                ставляют хотя бы на время отвлечься от пор и подумать
разовать водную пору, то она будет стремиться к рас-                             о каком-то варианте эндоцитоза, при котором адсорб-
ширению, так как это сопровождается уменьшением                                  ция ДНК на мембране инициирует образование инва-
электрической компоненты свободной энергии, так же                               гинации с последующим проникновением внутрь
как в приведенном выше школьном опыте. Зависи-                                   клетки. Обратимся в связи с этим к красивым опытам,
мость ∆W(r), описываемая формулой (1), показана на                               выполненным в лаборатории В.Г. Будкера [5] в ходе ис-
рис. 2, в. Из него следует, что энергия гидрофильной                             следования взаимодействия ДНК с однослойными ли-
поры зависит от ее радиуса, причем она вначале растет,                           посомами. Прежде всего была измерена степень захвата
а потом падает. Иными словами, на кривой этой зави-                              радиоактивно меченой ДНК липосомами в зависимос-
симости имеется энергетический барьер. Если поры уз-                             ти от концентрации Mg2+. При отсутствии или при ма-
кие, то их расширение невыгодно, поскольку требует                               лых концентрациях Mg2+ липосомы вообще не “загла-
дополнительной энергии. Однако если за счет тепло-                               тывали” ДНК. С ростом концентрации Mg2+ степень
вых флуктуаций возникает широкая пора, отвечающая                                захвата доходила до нескольких процентов. Роль Mg2+
максимальной энергии, то дальше она будет расши-                                 состояла, видимо, в том, что эти ионы способствовали
ряться самопроизвольно. Это приводит в конце концов                              адсорбции ДНК на поверхности липосом. В следую-
к разрушению мембраны. При наложении электричес-                                 щей серии опытов изучался захват ДНК липосомами
кого поля высота барьера существенно понижается, а                               при наложении короткого импульса сильного электри-
значит, уменьшается и время жизни бислоя. Из форму-                              ческого поля. Степень захвата повышалась примерно в
лы (1) легко находятся высота активационного барьера                             10 раз, причем эффект наблюдался даже при отсутст-
и среднее время жизни мембраны.                                                  вии ионов Mg2+. Удалось показать, что ДНК, проникая
                                                                                 в липосомы окружена липидной оболочкой, то есть
    Поры в мембранах, о которых шла речь выше, име-                              реализуется процесс типа эндоцитоза (рис. 3, а–г).
ют гидрофильную кромку, выстланную полярными го-                                 Доказано это с помощью использования радиоак-
ловками липидных молекул (рис. 2, д). Возникают они                              тивно меченой ДНК и водорастворимого красителя



        Ч И З М А Д Ж Е В Ю . А . П Е Р Е Н О С Н У К Л Е И Н О В Ы Х К И С Л О Т В Т К А Н И И К Л Е Т К И ( Н А П У Т И К Г Е Н Н О Й Т Е РА П И И )   27


                                                                БИОЛОГИЯ
     этидиум-бромида (EtB), флуоресценция которого рез-                            внутренняя организация слишком сложна. Электрон-
     ко возрастает после его связывания с ДНК (рис. 3, а).                         ная микроскопия клеток E. coli после их электротранс-
     Оказалось, что после проникновения ДНК в липосомы                             фекции плазмидной ДНК не выявила появления внут-
     флуоресценция EtB остается той же, что была в контро-                         ри клеток каких-либо везикулярных образований.
     ле, но резко возрастает после озвучивания суспензии, в                        Одновременно с этим накопилось множество косвен-
     результате чего разрушаются все липидные оболочки и                           ных данных, которые говорят в пользу прохождения
     возникает возможность для связывания EtB с ДНК.                               ДНК через электропоры. Перечислим наиболее впе-
         Возникает естественный вопрос: а в чем, собствен-                         чатляющие результаты, полученные В.А. Кленчиным,
     но, заключается роль электрической обработки, кото-                           С.И. Сухаревым и др. [6, 7], которые в известной степе-
     рая, очевидно, вызывает обратимую порацию мембра-                             ни решили проблему “малая пора – большая ДНК”.
     ны. Почему электропорация способствует захвату ДНК                            Прямыми опытами было доказано, что электрофорез
     липосомами, который идет по эндоцитозному пути?                               ДНК, то есть увлечение этих молекул электрическим
     Можно попытаться объяснить это следующим обра-                                полем, играет важнейшую роль и на стадии переноса
     зом. Представьте, что у вас в руках находится надутая                         ДНК из объема раствора к поверхности клетки, и во
     волейбольная камера, и попытайтесь надавить на нее                            время прохождения ДНК через мембрану (рис. 4, а, б ).
     пальцем, чтобы сформировать инвагинацию. Сделать                              Предложенная двухимпульсная методика (рис. 5, а),
     это будет значительно легче, если давление в камере                           когда вслед за коротким мощным импульсом после оп-
     немного снизить. Если появление пор снижает давле-                            ределенной задержки следует низковольтовый длин-
     ние и соответственно натяжение мембраны, будет легче                          ный импульс, позволила отдельно управлять порацией
     создать инвагинацию и осуществить захват ДНК липо-                            и переносом. Было установлено, что введение плаз-
     сомой. К сожалению, эта гипотеза не была проверена                            мидной ДНК до порирующего импульса является не-
     экспериментами.                                                               обходимым условием высокого уровня трансфекции.
                                                                                   Если же ДНК вводится между порирующим и форети-
        Экстраполировать эти результаты на случай клеток
                                                                                   ческим импульсами, трансфекция практически равна
     было бы слишком смело, а провести описанные выше
                                                                                   нулю. Отсюда следует принципиальный вывод – элек-
     опыты с клетками практически невозможно, так как их
                                                                                   трическое поле оказывает мощное давление на плаз-
                                                                                   мидную ДНК и опосредованно на мембрану в области
      I                                                                            малой поры, расширяя ее и деформируя мембрану. Это
            a
                                                                                   подтверждено прямыми опытами с использованием
                                             б                          1          декстранов разного размера (рис. 5, б, в). А именно, в
                                                                                   течение десятков секунд после прохождения ДНК по-
                                                                  2
                                                                                   ры остаются настолько расширенными, что в клетки
                                                                                   проникают декстраны крупного размера с молекуляр-
                                                                                   ным весом до 20 000. Таким образом, электротрансфек-
                           2                                                       ция чем-то похожа на обстрел ткани из “генного писто-
                                             в                                     лета”, только роль золотых пуль здесь играют молекулы

                                                                                                Направление                    ЭТ
                                                                                               электрофореза                   70
                                                                                     a              ДНК                             б

                                                                                                                               50
                                             г
                          1                                                                                                    30

                   600         630
                               нм                                                                                              10

          Рис. 3. а – спектры флуоресценции I липосом с                                                                                 1    2
          этидийбромидом, подвергнутых электрообработке
          (12,5 кВ/см, 0,3 мс) в присутствии ДНК и отмытых                               Рис. 4. а – схематическое изображение экспери-
          стандартным образом от несвязавшейся ДНК, полу-                                ментальной системы, позволяющей изучать роль
          чены до (1) и после (2) ультразвуковой обработки су-                           направления электрического поля в электротранс-
          спензии; б–г – плазмидная ДНК (красные кружки, (1))                            фекции. Красными точками показаны молекулы
          адсорбируется на поверхности липосомы (2), в ре-                               ДНК; б – зависимость эффективности трансфекции
          зультате чего образуется инвагинация, а затем мини-                            в монослое от полярности импульса: 1 – электрофо-
          липосома внутри липосомы (2), содержащая ДНК                                   рез ДНК от клеток, 2 – к клеткам




28                                   С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 8 , № 2 , 2 0 0 4


                                                                 БИОЛОГИЯ
 E1, t1                           Fin, отн. ед.                             Fin, отн. ед.
                 a                                    б                                         в                                      г
                                  200                                       5
                                                                                                                           1
                                                                            4
                                  150
                                                                            3
                                  100                 1
                                                                            2                                              2
               E2, t2
                                   50                 2
                                                                            1
                                                                            0
    ∆t                               0            1       10     100 c           ФД4        ФД20 ФД40 ФД70

                        Рис. 5. а – протокол двухимпульсного эксперимента. Параметры импульсов: E1 , t1 , E2 , t2 –
                        амплитуды (в В/см) и длительности первого и второго импульсов соответственно, ∆t – за-
                        держка между импульсами; б – относительные количества захваченного клетками ФД20
                        при введении этого декстрана в суспензию клеток через различное время после электро-
                        обработки одним импульсом 1,5 кВ/см, 1 мс в присутствии 0,1 мг/мл ДНК (1) и без ДНК (2).
                        Крайние левые значения на кривых (t = 0) получены при введении ФД20 до приложения им-
                        пульса. Штриховой линией показан уровень флуоресценции клеток в контроле без импуль-
                        са. По оси ординат отложена интенсивность флуоресценции декстранов; в – относительное
                        увеличение количества захваченных клетками декстранов различного размера при обра-
                        ботке импульсом 1,5 кВ/см, 1 мс в присутствии 0,1 мг/мл ДНК. Контрольные значения, по-
                        лученные при отсутствие ДНК (светлые столбцы), во всех случаях приняты за единицу; г –
                        возможные структурные изменения мембраны при взаимодействии с ДНК в сильном элек-
                        трическом поле: 1 – расширение поры при прохождении ориентированной молекулы ДНК,
                        2 – возникновение разреза в мембране нитью ДНК, вовлеченной одновременно в две поры


плазмидной ДНК, увлекаемые не механической, а элек-                                превышает нескольких атмосфер, увеличение прони-
трической силой (рис. 5, г, 1 ). Механизм переноса через                           цаемости является обратимым.
поры гигантских молекул ДНК, присутствующих в рас-
творе в виде статистических глобул, должен отличаться                                    ЛИТЕРАТУРА
от описанного выше, хотя и там движущей силой, ви-                                 1. Титомиров А.В., Зеленин А.В. Новые методы трансфекции
димо, является электрофоретическая (рис. 5, г, 2 ).                                клеток млекопитающих // Молекуляр. биология. 1988. Т. 22,
                                                                                   № 6. С. 1445–1450.
                                                                                   2. Черномордик Л.В. Электрический пробой биологических
    УЛЬТРАЗВУКОВАЯ ОБРАБОТКА                                                       мембран // Успехи соврем. биологии. 1985. Т. 99. С. 67–80.
                                                                                   3. Антонов В.Ф. Липидные поры: Стабильность и проницае-
    Литературные данные, относящиеся к сравнитель-                                 мость мембран // Соросовский Образовательный Журнал.
ному исследованию эффективности трансфекции при                                    1998. № 10. С. 10–17.
электро- и ультразвуковой обработке клеточных сус-                                 4. Чизмаджев Ю.А. Мембранная биология: от липидных би-
пензий, показали, что оба метода позволяют получить                                слоев до молекулярных машин // Там же. 2000. № 8. С. 12–17.
примерно 100-кратное увеличение трансфекции по                                     5. Черномордик Л.В., Соколов А.В., Будкер В.Г. Электростиму-
сравнению с контролем. Это говорит о том, что ультра-                              лируемый захват ДНК липосомами // Биол. мембраны. 1989.
                                                                                   Т. 6, № 2. С. 212–217.
звук, как и электрическое поле, существенно повыша-
                                                                                   6. Кленчин В.А., Серов С.М., Сухарев С.И. и др. Электрофорез
ет проницаемость клеточных мембран, хотя механизм                                  ДНК играет важную роль в электростимулируемой трансло-
его действия иной. Как известно, при излучении в                                   кации ДНК в клетки // Там же. 1991. Т. 8, № 7. С. 769–777.
жидкость звука во время полупериодов разряжения                                    7. Сухарев С.И., Кленчин В.А., Серов С.М. и др. О механизме
создаются условия для возникновения кавитации. На-                                 электроиндуцируемого переноса ДНК через плазматическую
                                                                                   мембрану // Там же. 1992. Т. 9, № 4. С. 405–419.
помним, что кавитацией называется образование в
жидкости газовых пузырьков, которые образуются в                                                                      ***
тех местах, где давление в жидкости становится ниже
давления насыщенного пара этой жидкости. Во время                                  Юрий Александрович Чизмаджев, доктор химических
полупериодов сжатия пузырьки схлопываются, созда-                                  наук, профессор кафедры биофизики МГУ, член-кор-
                                                                                   респондент РАН, зав. лабораторией биоэлектрохимии
вая кратковременные (порядка 10− 6 с) импульсы давле-
                                                                                   Института электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН. Лау-
ния вплоть до 103 атм, способные разрушить даже                                    реат Государственной премии СССР в области науки и
прочные материалы. Коллапс пузырька приводит к                                     техники и премии им. Дж. Милаццо Международного
возникновению в жидкости локальных потоков и удар-                                 биоэлектрохимического общества. Область научных
ных волн. По-видимому, последние и являются причи-                                 интересов – биофизика мембран. Автор 270 научных
ной разрушения клеточных мембран. Если давление не                                 трудов и трех монографий.



          Ч И З М А Д Ж Е В Ю . А . П Е Р Е Н О С Н У К Л Е И Н О В Ы Х К И С Л О Т В Т К А Н И И К Л Е Т К И ( Н А П У Т И К Г Е Н Н О Й Т Е РА П И И )   29



    
Яндекс цитирования Яндекс.Метрика