Единое окно доступа к образовательным ресурсам

Идентификация и исследование экспрессии генов: Учебно-методическое пособие для вузов

Голосов: 1

Учебно-методическое пособие подготовлено на кафедре физиологии и биохимии растений биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета. Рекомендуется для студентов 3 и 4 курсов дневного обучения биологопочвенного факультета для специальности 020201 - "Биология". Пособие содержит описания 23 лабораторных работ, сгруппированных в два раздела: методы работы с нуклеиновыми кислотами и методы анализа нуклеиновых кислот.

Приведенный ниже текст получен путем автоматического извлечения из оригинального PDF-документа и предназначен для предварительного просмотра.
Изображения (картинки, формулы, графики) отсутствуют.
     ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
   ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
              УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
    «ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
             УНИВЕРСИТЕТ»




                 А.Т. Епринцев,
                  В.Н. Попов,
                 Д.Н. Федорин




       ИДЕНТИФИКАЦИЯ
 И ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ
           ГЕНОВ
     Учебно-методическое пособие для вузов




       Издательско-полиграфический центр
   Воронежского государственного университета
                      2008


Утверждено научно-методическим советом биолого-почвенного факультета
14 февраля 2008 г., протокол № 6



Рецензент доктор биологических наук, профессор М.А. Наквасина




Учебно-методическое пособие подготовлено на кафедре физиологии и
биохимии растений биолого-почвенного факультета Воронежского госу-
дарственного университета.


Рекомендуется для студентов 3 и 4 курсов дневного обучения биолого-
почвенного факультета.




Для специальности 020201 – Биология



                                  2


                                                 Оглавление

Раздел 1. Методы работы с нуклеиновыми кислотами. .......................... 5

Глава I. Выделение и очистка нуклеиновых кислот. .............................. 6

Работа 1. Методика выделения РНК методом фенол-хлороформной
экстракции в присутствии хлорида лития. ..............................................                             9
Работа 2. Методика выделения геномной ДНК с использованием
СТАВ. ..........................................................................................................   11
Работа 3. Методика быстрого выделения РНК из грамм (-) бактерий.                                                   12
Работа 4. Методика экстракции ДНК из агарозного геля
с использованием наборов фирмы QIAEX II. ........................................                                  13

Глава II. Определение качественных и количественных показателей
нуклеиновых кислот. .................................................................................. 14

Работа 5. Определение концентрации ДНК или РНК. ........................... 15
Работа 6. Определение чистоты препарата ДНК или РНК. ................... 16
Работа 7. Методика электрофореза нуклеиновых кислот
в агарозном геле. ........................................................................................ 18

Раздел 2. Методы анализа нуклеиновых кислот. ....................................

Глава I. Обратная транскрипция. ........................................................... 19

Работа 8. Методика проведения обратной транскрипции
с использованием фермента M-MuLV Reverse Transcriptase. ...............                                            22

Глава II. Полимеразная цепная реакция. .................................................. 23

Работа 9. Методика проведения полимеразной цепной реакции. ......... 26

Глава III. Полимеразная цепная реакция в реальном времени
(Real-Time PCR). ......................................................................................... 28

Работа 10. Методика амплификации с использованием красителя
SYBR Green. ............................................................................................... 34
Работа 11. Методика амплификации ДНК с применением
зондов Taqman. ........................................................................................... 36
Работа 12. Обработка данных. .................................................................. 37

Глава IV. Гибридизация нуклеиновых кислот. ......................................... 41
                                                          3


Работа 13. Использование биотин-11-dUTP
для нерадиоактивного мечения ДНК методом ПЦР ..............................                              44
Работа 14. Использование биотин-11-dUTP для нерадиоактивного
мечения ДНК методом удлинения затравки. ..........................................                       45
Работа 15. Проведение гибридизации ДНК по Саузерну. .....................                                46
Работа 16. Выявление меченых ДНК с образованием
нерастворимого окрашенного продукта. .................................................                   48
Работа 17. Дот-блот-гибридизация ПЦР-амплифицированной ДНК. ......                                       49

Глава V. Клонирование ДНК в бактериальные системы. ...................... 49

Работа 18. Приготовление компетентных клеток. ..................................                         56
Работа 19. Трансформация бактериальных клеток методом
«холодового шока». ...................................................................................   57
Работа 20. Выделение плазмидной ДНК (лизис щелочью). ..................                                  58
Работа 21. Выделение плазмидной ДНК методом
фенол-хлороформной экстракции (экспресс-метод). .............................                            60
Работа 22. Определение вставки ДНК в трансформированных
клетках методом рестрикции. ...................................................................          61
Работа 23. Идентификация вставки ДНК в трансформированных
клетках методом ПЦР. ...............................................................................     61




                                                     4


     Раздел 1. Методы работы с нуклеиновыми
кислотами
     Исследования в области молекулярной биологии связаны с целена-
правленным манипулированием фрагментами нуклеиновых кислот (НК)
или целыми генетическими конструкциями, целью которых является полу-
чение с помощью лабораторных методов организмов с новыми, в том чис-
ле и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных
свойств. Таким образом, изменение наследственных свойств организма с
помощью генной инженерии сводится к конструированию из различных
фрагментов нового генетического материала, введения этого материала в
рецепиентный организм, создания условий для его функционирования и
исследования его уровня экспрессии. В основе молекулярной биологии
лежат современные методы физико-химической биологии. Данные методы
позволяют получать в чистом виде генетический материал клетки, прово-
дить с ним различные манипуляции, позволяющие идентифицировать как
отдельные компоненты, так и целый геном организма. Важным в изучении
функционирования живого организма является исследование функцио-
нальной активности генетического материала клетки.
     На первой стадии проведения анализа проба подвергается специаль-
ной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного мате-
риала, удаление белковых и полисахаридных фракций и получение раство-
ра ДНК или РНК, свободного от ингибиторов и готового для дальнейшей
амплификации. Выбор методики выделения ДНК (РНК) в основном опре-
деляется характером используемого материала.
     В зависимости от типа биологического материала лизис клеток осу-
ществляется различными способами. Клетки биоматериала разрушаются
различными способами, наиболее часто используемым из которых являет-
ся механическое разрушение. Часто (в случае работы с растительными и

                                  5


бактериальными клетками) возникает необходимость применения допол-
нительных компонентов для избавления от клеточной стенки (лизирующие
ферменты, детергенты и т. д.).
     После разрушения образца возникает необходимость очистки нук-
леиновых кислот от других компонентов клеток. Для этого существуют
различные методы, основанные на специфических свойствах нуклеиновых
кислот. Наиболее часто используется очистка НК методом фенол-
хлороформной экстракции, основанной на различной растворимости НК в
растворителях разной природы. Кроме того, применяются методы, осно-
ванные на способности НК адсорбироваться на специфических носителях с
последующей их элюцией.


           Глава I. Выделение и очистка нуклеиновых кислот


     Метод стал широко использоваться для выделения НК из биологиче-
ских образцов различных источников. Данный метод позволяет выделять в
чистом виде не только суммарною вытяжку НК, но и разделить между со-
бой ДНК и РНК. Принципиальная основа метода заключается в том, что
НК имеет высокую растворимость в водной фазе, в то время как большая
часть белков, углеводов и других компонентов клетки растворяются в ор-
ганических растворителях.
     На первой стадии происходит суммарное выделение РНК и ДНК, в
присутствии гуанидин изотиоционата, ацетата натрия и других компонен-
тов. Гуанидин изотиоционат – один из самых мощных денатурантов белка.
Очень эффективен при очистке РНК из-за его способности быстро прони-
кать в клетки и подавлять активность РНКаз. Гуанидин изотиоционат, ис-
пользуемый комбинации со смесью фенол-хлороформ и осаждением спир-
та, что обеспечивает получение качественной неповрежденной РНК. Кро-
ме того, вместо гуанидин изотиоцианата часто используется додецилсуль-
                                  6


фат натрия, также вызывающий лизис клеток и ингибирование клеточных
нуклеаз.
     Применение фенола и хлороформа при выделении НК способствует
созданию двухфазной системы. Фенол отделяет белки от ДНК. Хлороформ
денатурирует белок и липиды и помогает поддерживать разделение орга-
нической и водной фазы, а также делает ДНК менее растворимой в феноле.
При pH 7–8, происходит растворение ДНК и РНК в водной фазе, в то вре-
мя как белки образуют непрозрачный слой между фазами. В кислых усло-
виях (рН < 5), суммарная РНК остается в верхней водной фазе, в то время
как большая часть ДНК и белков остается или в интерфазе, или в органи-
ческой фазе. Суммарная РНК впоследствии может быть выделена осажде-
нием с изопропиловым спиртом. Регулируя содержание фенола и его pH,
можно добиться разделения ДНК и РНК между собой, при этом ДНК будет
находиться в органической фазе, в то время как РНК будет в водной фазе.
На данной стадии возможно добавление изоамилового спирта, чтобы пре-
дотвратить вспенивание.
     Добавление одновалентных катионов (K, Na, NH4) при выделении
НК приводит к формированию соли с отрицательно заряженными нуклеи-
новыми кислотами. Добавление спирта (этанол или изопропиловый спирт)
приводит к обратимой денатурации нуклеиновых кислот. LiCl часто ис-
пользовался, чтобы денатурировать РНК, хотя осаждение со спиртом и од-
новалентным катионом типа натрия или иона аммония намного более ши-
роко используется. Осаждение LiCl имеет преимущества перед другими
методами осаждения РНК, в которых не происходит эффективного удале-
ния ДНК, белок или углеводы. Другое преимущество состоит в том, что
литиевое осаждение эффективно удаляет несвязанные нуклеотидфосфаты,
которые учитываются при количественном анализе концентрации методом
спектрофотометрии.


                                   7


  Рис. 1. Схематичный процесс выделения нуклеиновых кислот методом
                   фенол-хлороформной экстракции


     Существует и иной способ экстракции нуклеиновых кислот, в основе
которого лежит способность ДНК и РНК сорбироваться на различного ро-
да носителях (пористое стекло, силикагель, смолы и др.). Принцип данного
метода заключается в сорбции НК на носителе за счет слабых связей (во-
дородные связи, электростатические силы, бисульфидные мостики и т. д.),
и последующей их элюцией солевыми растворами с высокой ионной си-
лой. На основе использования магнитных частиц или других сорбентов на
поверхности которых имеются ковалентно связанные poly-Т олигонуклео-
тидные последовательности разной длины, можно выделять чистые препара-
ты мРНК для исследования экспрессионной активности генома образцов.




                                   8


     Рис 2. Схема выделения нуклеиновых кислот с использованием
                     различного рода сорбентов


Работа 1. Методика выделения РНК методом фенол-хлороформной
экстракции в присутствии хлорида лития


  1. Растворить образец ткани в буфере D (4M гуанидин изотиоционат,
  30 мM цитрат натрия, 30 мM β-меркаптоэтанол, pH 7.0–7.5).


                                 9


   2. Поместить пробирку на лёд. Добавить один объём фенола и переме-
   шать. Добавить 1/5 объёма смеси хлороформ : изоамиловый спирт (24 : 1)
   и перемешать образец. Перемешать на вортексе ещё 4 раза по 1 мин.
   Между перемешиваниями пробирки инкубировать на льду.
   3. Открутить на максимальной скорости при 4 °С в течение 30 мин.
   Верхнюю (водную) фазу перенести в новую пробирку.
   4. Добавить 1 мкл соосадителя и 2 объёма 96 % этанола. Перемешать на
   вортексе и немедленно открутить на максимальной скорости при RT в
   течение 10 мин.
   5. Промыть осадок 80 % этанолом и высушить на воздухе до исчезно-
   вения следов спирта. Не пересушивать!!!
   6. Растворить осадок в 100 мкл деионизованной воды. Добавить равный
   объём 12М LiCl и охладить раствор в течение 30 мин при –20 °С.
   7. Открутить на максимальной скорости 15 мин при комнатной темпе-
   ратуре. Промыть осадок 0.8 мл 80 % этанола.
   8. Осадок высушить, как описано ранее, и растворить в 40 мкл деиони-
   зованной воды, свободной от РНКаз.
   9. Определить концентрацию и чистоту полученного препарата РНК.


Комментарии к методике:
1) Объем ткани не должен превысить 1/5 объема буфера D. Чтобы избегать деградации
   РНК, гомогенизация ткани должна быть выполнена так быстро и полностью, на-
   сколько возможно.
2) При выделении РНК может происходить загрязнение геномной ДНК. Однако, если
   ее количество не превышает по свечению РНК в агарозном геле с бромистым эти-
   дием, такое загрязнение не является критичным и дает возможность использовать
   полученный препарат РНК в дальнейшем.
3) Для хранения выделенной РНК, добавьте 0.1 объема 3М ацетата натрия и 2.5 объе-
   мов 96 % этанола к РНК в воде и смешайте полностью. Образец может быть сохра-
   нен в течение нескольких лет в –20 °C.

                                            10



    
Яндекс цитирования Яндекс.Метрика