Единое окно доступа к образовательным ресурсам

Основы биотехнологии: культивирование изолированных клеток и тканей растений. Учебно-методическое пособие. Часть 2

Голосов: 8

Рассмотрены вопросы культивирования in vitro изолированных клеток, каллусных тканей и протопластов растений, техник введения в культуру и методы культивирования изолированных клеток и тканей, прикладные аспекты культивирования растений in vivo, in vitro, промышленное производство БАВ из культуры клеток растений. Учебное пособие предназначено для студентов направления 655500 "Биотехнология", 655600 "Производство продуктов питания из сырья растительного происхождения".

Приведенный ниже текст получен путем автоматического извлечения из оригинального PDF-документа и предназначен для предварительного просмотра.
Изображения (картинки, формулы, графики) отсутствуют.
                                                                           Гиббереллины обнаружены у сумчатого гриба (аскомицета)
                                                                  Gibberella fujikuroi, а также в тканях высших растений.
                                                                       Гиббереллины – это дитерпеноиды с тетрациклическим гиб-
                               - кинетин (6-                      береллановым скелетом из 19-20 С-атомов.
                               фурфуриламинопурин)                     Для практических целей наиболее часто используют гиббе-
                                                                  релловую кислоту, которая производится в промышленности.
                                                                       Обработка гибберелловой кислотой семян и клубней приво-
                                                                  дит к снятию у них покоя и стимулирует быстрое прорастание. Ее
                                                                  действие на озимые злаки заменяет яровизацию, необходимую для
      Действие цитокининов проявляется прежде всего в ускоре-     таких растений.
нии клеточных делений, что опосредуется усилением синтеза ДНК          В составе культуральных сред используют гибберелловую
и РНК и белков. Благодаря этому замедляется старение клеток и     кислоту для поддержания роста суспензионных культур, а также
повышается их устойчивость к неблагоприятным факторам среды.      для индукции побегообразования.
      Цитокинины в составе сред включают для стимуляции кле-
точного деления в каллусных и суспензионных культурах, в куль-
турах протопластов, при регенерации проростков из соматических
эмбриондов или стеблевых почек.                                                                       - гибберелловая кислота
      При культивировании протопластов в составе культурных
сред используют и абсцизовую кислоту. Абсцизовая кислота ока-
зывает противодействие ауксинам, гиббереллинам и цитокининам.
      Гиббереллины оказывают множественные действия: стиму-
лируют рост в фазе растяжения и деления клеток (например, кам-
                                                                        В настоящее время известно большое число различных по
бия), вызывают рост плодов. Важное свойство гиббереллинов –
вызывать вытягивание стебля у розеточных растений или у расте-    составу питательных сред (табл.2). Среда Mypacсиге и Скуга – са-
ний с укороченным стеблем, т.е. устранять физиологическую и ге-   мая универсальная. Она пригодна для образования и роста каллу-
нетическую карликовость.                                          сов, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений.
      Гиббереллины относят к условно половым гормонам; напри-     Так изменение соотношения ауксина и кинетина приводит к обра-
мер, у тыквенных они способствуют образованию мужских цвет-       зованию либо корней (преобладание ауксина), либо стеблевых
ков.                                                              культур (преобладание кинетина). Среда Ганборга и Эвелега под-
      Для гиббереллинов доказано их непосредственное действие     ходит для культивирования клетокк и тканей бобовых растений и
                                                                  злаков. Среда Уайта обеспечивает укоренение побегов и нормаль-
на биосинтез ферментов, например, α-амилазы и других гидролаз в
                                                                  ный рост стебля после регенерации, а среда Нича и Нич пригодна
прорастающих семенах злаков; эти ферменты расщепляют крахмал
                                                                  для индукции андрогенеза в культуре пыльников. В состав некото-
до простых сахаров, которые усваиваются развивающимся заро-
                                                                  рых сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или
дышем.


                                                        23              24


ее натриевая соль, которые улучшают доступность железа для кле-                       1            2        3         4         5
                                                                               рит, агароза        -                  -
ток.

                                                             Таблица 2
Состав питательных сред, применяемых при культивировании клеток и тканей         2.3. Влияние физических факторов.
                           (по Р.Г.Бутенко, 1999)                                На рост и развитие растительных тканей in vitro большое
                             Концентрация питательных сред, мг/л           влияние оказывают физические факторы – свет, температура,
                       Мурасиге Гамборга                    Нича и         аэрация, влажность.
  Компонент сред                                  Уайта,
                         и Ску-      и Эвеле-              Нич,1974              Свет. Большинство каллусных тканей могут расти в условиях
                                                   1939
                         га,1962     га,1968                 -1975
         1                2           3          4           5
                                                                           сильного освещения или в темноте, так как они не способны фото-
        KNO3             1900       3000        81          950            синтезировать. Вместе с тем свет может выступать как фактор,
       NH4NO3            1650         -          -          72             обеспечивающий морфогенез и активирующий процесс вторично-
       Ca(NO3)2            -          -         142          -             го синтеза. В качестве источника света используют люминесцент-
   Ca(NO3)2⋅4H2O           -          -          -           -             ные лампы. Для большинства растений оптимум освещенности со-
      (NH4)2SO4            -         134         -           -
                          370        500        74          185            ставляет примерно 1000 люкс. Кроме интенсивности освещенности
    MgSO4⋅7H2O
      СaCl2⋅H2O            -          -          -          166            на культуру ткани и её физиологические особенности влияет каче-
     CaCl2⋅2H2O           440        150         -           -             ство света. Так, более 20 флавонов и флавонолевых гликозидов об-
         KCl               -          -         65           -             разуются в культурах клеток петрушки после освещения её непре-
       KH2PO4             170         -         12          68             рывным люминесцентным светом «холодный белый».
    NaH2PO4⋅H2O            -         150         -           -
                           -         10          -           -                   Температура. Для большинства каллусных культур опти-
     MnSO4⋅Н2О
                         22,3         -          -          25             мальна температура 26°С. В отличие от роста культур клеток и
    MnSO4⋅4Н2О
     ZnSO4⋅4Н2О
                          8,6         -          -           -             тканей индукция их морфогенеза требует более низких температур
                           -          2          -          10             (18-20°С).
     ZnSO4⋅7Н2О           6,2         3          -          10
        H3BO4            0,025      0,075        -        0,025
                                                                                 Аэрация. Для выращивания суспензионных культур большое
     CuSO4⋅5Н2О          0,25       0,25         -         0,25            значение имеет аэрация. Особенно важно снабжение воздухом
   Na2MoO4⋅2Н2О          0,025        -          -           -             культивируемых клеток в больших объемах ферментеров.
     CoCl2⋅6Н2О          27,8         -          -         27,8                  При выращивании клеток в малых объемах (в колбах) нор-
     FeSO4⋅7Н2О          37,3         -          -         37,3            мальная аэрация достигается при постоянном перемешивании сус-
   NaEDTA⋅2Н2О             -         28          -           -
  Cеквестрен 330-Fe       100         -          -          200
                                                                           пензии.
     Мезоинозит            -          -          -           3                   Влажность. Оптимальная влажность в помещении, где растут
Аскорбиновая кислота       -                     -           3             культуры, должны составлять 60-70%.
    Тиамин – HCl          0,5         -          -           1
  Пиридоксин – HCl        0,5         -          -           -
Никотиновая кислота       0,5         -          -        60 000
       Сахароза         30 000     20 000      2000        7000
                                                                               2.4. Методы культивирования изолированных клеток и
 Агар «Дифко», гель-                                                       тканей для получения БАВ.
                                                                   25            26


     В качестве источника БАВ используют каллусную ткань, ко-      небольшие агрегаты (по 5-10 клеток). Более пригодна каллусная
торую получают твердофазным способом культивирования и глу-        ткань рыхлого типа, которая легко фрагментируется на отдельные
бинным суспензионным культивированием, осуществленным в пе-        клетки и небольшие агрегаты при перемешивании её в нере…..
риодическом и непрерывном (проточном) режимах (Чуегов и др.,       жидкую среду. Трансплантат желательно обрабатывать пектина-
2003).                                                             зой. Рекомендуется использовать среды, содержащие 2,4-
                                                                   дихлорфеноксиуксусную кислоту и не содержащие ионы Ca. При
     2.4.1. Твердофазный способ культивирования.                   подборе среды культивирования важно из среды исключить цито-
     Каллусные клетки получают из фрагментов тканей разных         кинины или снижать их концентрацию, а концентрацию ауксинов
органов высших растений, помещая кусочки такой ткани в пита-       увеличивать.
тельную среду (пробирки, колбы, чашки Петри). Соблюдают стро-            Перед пересевом первичную культуру фильтруют через два
гую стерильность.                                                  слоя марли или через сита (нейлоновые, металлические), чтобы
     Чтобы обеспечить развитие каллусных клеток в питательных      отделить крупные агрегаты каллусной ткани и остатки трансплан-
средах (табл. 2), содержащих необходимые для роста вещества,       тата. На образование клеточных агрегатов также сказывает влия-
клетки тканей, запасающей паренхимы, корня и стебля, мезофилла     ние интенсивность перемешивания среды, так как клетки чрезвы-
листа и других тканей должны терять способность дифференци-        чайно чувствительны и быстро лизируются. Большинство клеток
ровки. Недифференцированному развитию клеток способствует          погибает.
прединкубация эксплантов на среде без гормонов в течение 3-6 су-         Суспензионные культуры, как правило, состоят из отдельных
ток.                                                               клеток, варьирующих по форме и размеру, и неоднородных много-
     Через 4-6 недели культивирования трансплантанта возникает     клеточных агрегатов. Соотношение отдельных клеток и таких аг-
первичный каллус, который необходимо перенести на свежую пи-       регатов в суспензии зависит от видовой принадлежности растения
тательную среду. При культивировании на агаризованных средах       и условий культивирования.
кусочек каллуса должен иметь массу 60-100 мг на 30-40 мл свежей          В процессе культивирования активно делящиеся клетки не
среды. Каллусная ткань, вырасшая на поверхности твердой пита-      только поглощают питательные вещества, но и выделяют продук-
тельной среды, имеет аморфную структуру, представляющую со-        ты собственной жизнедеятельности, в том числе и ферменты: α-
бой массу тонкостенных пареахимных клеток. Химический состав       амилаза, фосфогидролаза и др. они изменяют дисперсность сус-
каллусной ткани обычно незначительно отличается от соответст-      пензии. Повышать дисперсность суспензионных культур можно
вующего органа растения.                                           добавлением в среду низких концентраций пектиназы и целлюло-
     Каллусные клетки после ряда делений переходят на обычный      зы. При управлении процессом выращивания клеток важно иметь
для данного растения цикл развития, т.е. начинается дифферен-      гомогенную систему.
циация. Этот процесс регулируют гормоны.                                 Глубинное культивирование можно осуществлять в колбах
                                                                   на качалках при частоте вращения 100-120 об/мин. На 60-100 мл
     2.4.2. Глубинное суспензионное культивирование.               среды используют 2-3 г свежей каллусной ткани, чтобы начальная
     Для глубинного культивирования и получения суспензион-        плотность клеточной популяции составила 0,5⋅105 – 2,5⋅105 кле-
ных культур необходимо использовать линии клеток, образующих       ток/мл среды. Сосуды с суспензией закрепляют на платформе тей-

                                                         27             28


кера или устанавливают на качалки ротационного типа. В этих ус-     окрашивании препаратов красителями: 0,5 %-ным раствором синей
ловиях обеспечивается аэрация и, кроме того, нарастающая масса      Эванса или 0,01 %-ным раствором флуоресцеив-ацетата.
клеточных агрегатов распадается на отдельные фрагменты. В ла-            Во многих случаях изучение особенностей размножения и
бораторных условиях обычно используют сосуды объемом 100-250        роста клеток связано с необходимостью использования синхрони-
мл с небольшим объемом питательной среды.                           зированных клеточных популяций.
      Необходимо отметить, что растительные клетки растут и              Как правило, клеточная популяция суспензионных культур
размножаются значительно медленнее, чем клетки микроорганиз-        не только гетерогенна, но и асинхронна, так как содержит клетки,
мов. Время их удвоения 1-3сут. Процесс культивирования расти-       различающиеся по времени вхождения в митоз. Для синхрониза-
тельных клеток занимает 2-3 нед., что повышает требования к         ции клеточных культур используют методы индукции, когда тече-
обеспечению асептических условий.                                   ние клеточного цикла блокируется в определенном периоде под
      При выполнении работ с использованием культуры клеточ-        влиянием или физических факторов, например, пониженной тем-
ных суспензий необходимо знать их основные параметры.               пературой, или химических соединений.
      Плотность клеточной популяции - концентрация клеток в 1            Так, индукторами синхронизации в системе культивируемых
мл суспензии.                                                       клеток могут быть ингибиторы синтеза ДНК - тимидин, 5-
      Минимальное время удвоения клеточной популяции в нако-        аминоурацил, оксимочевина. В результате обработки клеток этими
пительной суспензионной культуре. Например, время клеточного        веществами клеточный цикл продолжается только до G1-периода,
удвоения для сахарной свеклы составляет 86 часов, табака - 48 ча-   и клетки накапливаются перед синтетическим периодом. Удаление
сов, фасоли - 22 часа.                                              из среды ингибитора приводит к синхронизированному переходу
      Вес сырого вещества суспензии определяют после помеще-        клеток к синтезу ДНК, а затем и делению.
ния ее на предварительно взвешенный фильтр из нейлоновой тка-            Другой способ синхронизации заключается в создании усло-
ни и промывания водой для удаления остатков питательной среды.      вий «голодания» по одному из компонентов культуральной среды
      Вес сухого вещества определяют после просушивания опре-       например, ауксину, цитокинину, углеводам, азоту. Клетки накап-
деленной навески сырой биомассы при 60-70 °С в течение суток.       ливаются в G1 или С2-периоде клеточного цикла.
      Количество клеток. Чтобы установить количество клеток в            Затем пассирование суспензии на среду с недостающим ком-
определенном объеме суспензии, необходимо диспергировать ее         понентом приводит к синхронизации клеточного деления.
содержимое до одноклеточного состояния обработкой 5-10% хро-             С помощью индукции синхронизации клеточных делений
мовой кислотой. Подсчет клеток проводят, используя 1 мл одно-       удается повысить митотический индекс с 2-3 % до 30-35 %.
клеточной суспензии, нанесенный на сетку счетной камеры.
      Размер клеток определяют их измерением под микроскопом с           Фазы ростового цикла в периодическом суспензионной
помощью шкалы окуляр-микрометра.                                    культуре.
      Жизнеспособность культуры определяют соотношением ко-              Ростовой цикл, или цикл выращивания - это период от помеще-
личества жизнеспособных клеток к общему количеству в милли-         ния инокулюма (части суспензионной культуры) на свежую среду до
литре суспензии. Жизнеспособные или живые культуры характе-         следующего субкультивирования.
ризуются наличием клеток с ядрами и движением цитоплазмы при

                                                          29              30


     Суспензионная культура представляет собой популяцию от-                   имеет место и активация клеточного метаболизма: увеличивается
дельных клеток и небольших клеточных агрегатов, которые, в                     содержание РНК, белка, ДНК, интенсивность поглощения кисло-
свою очередь, являются субпопуляциями, состоящими из не-                       рода. Все эти процессы приводят к активному делению клеток и
скольких клеток.                                                               образованию клеточных агрегатов.
     Несмотря на морфологическую и физиологическую гетероген-                        В течение поздней экспоненциальной фазы роста суспензи-
ность внутри популяции, рост клеточных культур описывается одно-               онной культуры наблюдается замедление клеточного деления, но
значно S-образной кривой (рис.1).                                              происходит увеличение размера клеток. Таким образом, увеличе-
                                                                               ние биомассы в этот период происходит в основном за счет растя-
                                                                               жения клеток.
                                                                                     Линейная фаза очень короткая. Удельная скорость роста
                                                                               культуры в этой фазе практически постоянная.
                                                                                     Фаза замедления роста (ранняя стационарная фаза). В этот
                                                                               период средний размер клеток продолжает возрастать, отмечается
                                                                               гетерогенность клеточной популяции и начало синтеза вторичных
                                                                               веществ.
                                                                                     Стационарная фаза. К этому периоду ростового цикла сус-
                                                                               пензионная культура достигает максимума сухого веса. В культу-
    Рис. 1. Рост клеточной популяции при культивировании в накопительном       ральной среде накапливаются продукты жизнедеятельности кле-
    режиме: 1 - латентная фаза; 2 - экспоненциальная фаза; 3 - линейная фаза   ток, угнетающие рост культуры. Культуральная среда истощается
              роста; 4 - фаза замедления роста; 5 - стационарная фаза          по наличию основных компонентов, обеспечивающих азотное,
                                                                               фосфорное, углеводное питание. С тем чтобы не наступила гибель
     Различают следующие фазы ростового цикла:                                 клеток, необходимо субкультивирование суспензионной культуры
     Латентная фаза (лаг-фаза). В этот период клетки не раз-                   на свежую среду.
множаются, отсутствует их видимый рост, но происходит актив-                         В среднем от начала культивирования до стационарной фазы
ный процесс поглощения воды и питательных веществ.                             роста проходит 21 -28 дней.
     Экспоненциальная (логарифмическая) фаза роста. Это огра-                        Продолжительность ростового цикла зависит от условий
ниченный период в ростовом цикле периодической (накопитель-                    культивирования, исходной плотности, возраста инокулюма, со-
ной) культуры, в ходе которого происходит экспоненциальное (ло-                става и объема питательной среды, видоспецифичности исходной
гарифмическое) увеличение количества клеток за счет их интен-                  культуры.
сивного деления, и как следствие - увеличение сухого вещества.
     Различают раннюю и позднюю экспоненциальные фазы. В
течение ранней экспоненциальной фазы наблюдается ряд цитоло-
гических изменений: в клетках исчезает большая вакуоль, проис-
ходит увеличение объема цитоплазмы, увеличивается число поли-
рибосом и митохондрий. Наряду с цитологическими изменениями
                                                                        31          32


     Непрерывное культивирование                                      3.1. Растения.
     Другой метод выращивания клеточных культур - непрерыв-           Растения являются продуцентами многих БАВ – соединений,
ное культивирование - основан на поддержании баланса между       способных оказывать слияние на биологические процессы в орга-
разбавлением питательной среды и удалением части суспензии.      низме. К таким соединениям принадлежат сердечные гликозиды,
     Установлено, что если при периодическом культивировании     сапонины, стерины, каратиноиды, полифенолы, алкалоиды, вита-
клеточных суспензий в экспоненциальной фазе роста в культу-      мины, хиноны, а также вещества, обладающие специфическим
ральную систему добавлять свежую среду, то деление клеток мо-    ароматом, вкусом и окраской.
жет поддерживаться неограниченно долго. Это послужило основой         Биологически активные вещества принадлежат к продуктам
создания систем, позволяющих осуществлять непрерывное куль-      вторичного обмена, которые называют вторичными метаболитами
тивирование.                                                     или вторичными продуктами биосинтеза. В настоящее время из-
     Культуральные системы, функционирующие непрерывно,          вестно более 100 000 вторичных метаболитов, продуцируемых
разделяют на полупроточные и проточные.                          растениями. Многие из них являются практически, экономически
     При полупроточном режиме выращивания через определен-       важными продуктами и используются в фармакологической, кос-
ные интервалы времени производится отбор части суспензии и       метической, пищевой промышленности. (табл.3)
разбавление оставшейся суспензии свежей средой. Через суспен-                                                        Таблица 3
зию пропускают стерильный воздух. Культуру перемешивают с             Промышленное использование некоторых растительных продуктов
помощью магнитной мешалки. Культивирование может продол-         Промышленное произ-
жаться в течение нескольких месяцев.                                                         Растительный продукт                Вид растения
                                                                      водство
     Проточный режим культивирования позволяет осуществлять                 1                          2                               3
непрерывное снабжение культуральной системы свежей средой с      Фармацевтические       Кодеин (алкалоид)               Papaver somniferum
удалением равного объема клеточной суспензии. В таком режиме     средства               Диосгенин (стероид)             Dioscorea deltoidea
автоматизированные ферментеры (культуральные сосуды) могут
                                                                                        Хинин (алкалоид)                Cinchona ledgeriana
функционировать в течение нескольких лет. Ферментеры, исполь-                           Дигоксин (сердечный гликозид)   Digitalias lanata
зуемые для производства больших клеточных биомасс, могут дос-
тигать объема до 1500 л. Для осуществления многостадийных про-                          Скополамин (алкалоид)           Datura stramonium
цессов при промышленном культивировании клеток-продуцентов                              Винкристин (алкалоид)           Catharanthus roseus
веществ вторичного обмена используют конструкции, состоящие      Агрохимикаты           Пиретрин                        Chrysanthemum cinerariaefolium
из системы нескольких ферментеров.                               Производство продук-   Хинин (алкалоид)                Cinchona ledgeriana
                                                                 тов питания
                                                                                        Тауматин (халькон)              Thaumatococcus danielli

 3. РАСТЕНИЯ И ИХ КУЛЬТУРА ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕ-                    Косметические          Жасмин                          Jasminum sp
  ТОК И ТКАНЕЙ КАК ПРОМЫШЛЕННЫЕ ИСТОЧНИКИ
                       БАВ                                            Лекарственные препараты составляют основную статью рас-
                                                                 хода веществ растительного происхождения, но скорее, в финан-

                                                       33              34


совом отношении, чем по объему. Лекарственные растения все еще                      niferum и кокаин Erythroxylon. Табак тоже принадлежит к этой
вносят значительный вклад в фармацевтическую промышленность,                        группе, поскольку содержит никотин.
составляя около 25% важнейших лекарственных средств. В табл. 4                            Стимуляторы – отличные от наркотиков вещества и в целом
приведены сведения о 10 основных лекарственных препаратах, их                       не вредны. Чаще всего применяют кофеин или связанные с ним
происхождении и клиническом действии. Это вещества не только                        теобромин, используя в виде напитков. Кофеин найден во многих
самых разнообразных химических форм, но и широкого спектра                          растениях, из которых наиболее известны Camellia sinensis (чай) и
терапевтического действия.                                                          Coffea arabica (кофе).
                                                                                          Яды – вероятно, крайнее лекарственное средство. Нейроток-
                                                               Таблица 4            сические яды растений все еще используют охотники в Африке и
           Десять наиболее употребляемых лекарственных веществ,                     Южной Америке, например, яд кураре. Многие растительные яды
                          получаемых из растений                                    обладают сильным нейротоксическим действием, например, рицин
 Лекарственное                                                                      из клещевины обыкновенной.
                                 Активность                     Растение – источник       Химикаты, применяемые в сельском хозяйстве. Помимо ре-
    вещество
       1                              2                                     3       гуляторов роста растений наиболее выдающимся событием было
Стероиды      из Противозачаточные средства                 Dioscorea deltoidea     открытие пиретринов. Перетрины, выделяемые из цветков Chry-
диосгенина
                                                                                    santhemum cinerariacfolium, являются мощными инсектицидами
Кодеин            Болеутоляющее                             Papaver somniferum
Атропин           Антихолинэргическое                       Atropa belladonna L. (уничтожающие насекомых). С природными пиретринами конку-
Резерпин          Снижающее давление                        Rauwolfia serpentina L. рируют синтетические, однако, при применении последних появ-
Геоциамин         Антихолинэргическое                       Hyoscyamus niger L. ляется устойчивость к ним у насекомых, а также возникает куму-
Дигоксин          Тонизирующее сердечную деятельность       Digitalis lanata L.     лятивная токсичность.
Скопомамин        Антихолинэргическое                       Datura metel L.               Тонкие химические соединения. «Тонкие химикаты» - это
Дигитоксин        Сердечно-сосудистые                       Digitalis purpurea L.   общее название веществ, применяемых в качестве добавок для ду-
Пилокарпин        Холинэргическое                           Pilocarpus jabonandi
Хинидин           Антималярийное                            Cinchona ledgeriana
                                                                                    хов, а также вкусовые ароматические вещества, красители пище-
                                                                                    вых продуктов. Это и очень дорогие, выпускаемые в небольших
      К лекарственным веществам примыкают наркотики и стиму-                        количествах вещества и дешевые препараты, производимые десят-
лирующие вещества. Наркотики являются промежуточным звеном                          ками тысяч тонн. Например, жасминовая эссенция.стоит в США
между ядами и лекарственными препаратами. В небольших коли-                         6000 долларов за 1 кг и производится в объеме лишь 20-30 кг в год,
чествах они часто являются эффективными лекарствами, например                       а масло какао, основной компонент шоколада, стоимостью 4 дол-
морфий. При высоких концентрациях или при постоянном приме-                         лара за 1 кг производится в объеме 20 000 т в год. Вещества варьи-
нении они могут стать причиной пагубного влечения (наркомании)                      руют от простых соединений типа хинина до сложных смесей типа
или смерти. Они представляют собой основную группу запрещен-                        эфирных масел. Последние представляют собой типичные моно-
ных натуральных продуктов. Наиболее известными являются ма-                         терпены, часто летучие соединения, составляющие основу про-
рихуана (или гашиш) из Cannabis, опиум и героин из Papaver som-                     мышленности, производящей ароматические соединения – отрас-
                                                                                    ли, создающие ценные и дорогостоящие продукты.

                                                                35                   36


      Следует отметить все возрастающий интерес промышленно-        свидетельствует об огромном синтетическом потенциале и разно-
сти к миру растений как к источнику химических соединений. Раз-     образии вторичного метаболизма; во-вторых, относительно не-
работка нового синтетического лекарственного препарата обхо-        большое число их пригодно для использования в промышленно-
дится примерно в 100 млн. американских долларов и занимает в 10     сти. К тому же, определенной трудностью биосинтеза является то,
лет, поэтому нетрудно понять возобновляющейся интерес к расте-      что во многих системах растений вторичные метаболиты накапли-
ниям как «фабрикам» для их синтеза.                                 ваются в значительных количествах на стационарной фазе роста; в
                                                                    физиологическом плане биосинтез БАВ связан с морфологическим
      3.2 Культура изолированных клеток и тканей растений.          развитием растения, с формированием дифференцированных тка-
      Культуры клеток и тканей, полученные in vitro, как и клетки   ней.
интактного растения, могут синтезировать вторичные метаболиты,            В настоящее время собрана большая коллекция клеточных
которые могут иметь большое практическое значение. Причем по        культур растений из различных семейств синтезирующие вторич-
качественному составу и количественному составу они могут схо-      ные метаболиты, широко используемые в промышленности. К ним
жи.                                                                 относятся: женьшень дальневосточный – источник диосгенина,
      Культуры клеток и тканей можно использовать для получе-       диоскорея дельтовидная – стероидные гликозиды, равольфия
ния природных веществ растительного происхождения следую-           змеиная – продуцент антиаритмического алкалоида аймалина и т.д.
щими способами:                                                     Установлено недавно, что клетки тиса ягодного синтезирует веще-
    - новые пути синтеза уже известных веществ, например ко-        ство-таксон, которое является антираковым препаратом.
        деина, хинина, пиретроинов;                                       Осуществляются большие научно-технологические исследо-
    - синтез новых продуктов из тех растений, которые трудно        вания по культивированию клеток и тканей растений in vitro.
        выращивать или внедрять, например тебаин из Papaver brac-         Прирост клеточной биомассы в условиях in vitro и in vivo
        teatum;                                                     может проходить с разной скоростью. Биомасса клеток женьшеня
    - использование культуры клеток как источника совершено         в суспензии при выращивании в 50 литровом ферментере увеличи-
        новых веществ, например, рутакультин из культур Ruta;       вается на 2,0 г в литре среды за сутки, что в 1000 раз больше, чем
    - использование культуры клеток в качестве систем для био-      выращивании на плантации.
        трансформации: как самого процесса с получением конеч-            Учитывая высокую стоимость женьшеня (килограмм планта-
        ного продукта, так и отдельного звена химического процес-   ционного корня стоит 100-150 дол. США; цена дикорастущего
        са, например при синтезе дигоксина.                         корня может доходить до нескольких тысяч долларов США) био-
      Практически важные результаты использования культуры          технологический способ получения биомассы культуры клеток
клеток и тканей были получены в 60-х годах ХХ века. Было пока-      женьшеня весьма привлекателен.
зано, что такие практически важные БАВ как диосгенин, гармин и            В таб. 5 приведены некоторые экономически важные продук-
виснагин синтезируются культурами клеток в тех же количествах,      ты, синтез которых получен в культуре клеток высших растений.
как в исходном растении.
      Скрининг, проведенные среди большого количества растений                                                                  Таблица 5
показал, что, во-первых, круг БАВ, синтезируемых в культурах,             Экономически важные продукты, полученные в культуре клеток
                                                                                    высших растений (по Р.Г. Бутенко, 1999)

                                                          37              38


                                                                             Для каждого продуцента БАВ, для каждого вновь образуемо-
Традиционные раститель-           Новые             Продукты
     ные продукты           активные вещества   биотрансформации
                                                                        го каллуса и суспензионной культуры растений разрабатывается
Алкалоиды                  Ингибиторы фито-     Метилдигоксин,          своя оптимальная среда, которая должна отвечать следующим ос-
                           вирусов              дигоксин                новным требованиям:
Стероиды                   Антиканцерогены,     Ментол                     1) обеспечивать хороший рост биомассы и максимально воз-
   терпены и терленоиды    композиции           Неоментол                      можное образование целевого продукта – алкалоидов, гли-
Бетанины                   Ингибиторы про-      Герониол                       козидов, полисахаридов и др. продуктов вторичного синте-
   гликозиды               теиназ необычные     Нерол
   полифенолы              белки                цитронеллол                    за;
   полисахариды                                                            2) содержать доступные по стоимости компоненты;
   эфирные масла                                                           3) обеспечивать применение наиболее экономических и эф-
   натуральные красители                                                       фективных приемов выделения и очистки БАВ.
(пигменты                                                                    Среды Мурасиге-Скуча (МС) и Шенке-Хильдебрандта (ШХ)
   убихинон
   вкусовые добавки                                                     относятся к наиболее употребляемым в работе с культурами кле-
   инсектициды                                                          ток растений и оказались эффективными для роста различных од-
   латекс                                                               но- и двудольных растений (табл. 2). Их считают средами с высо-
                                                                        ким содержанием солей (по сравнению с низкосолевой средой
                                                                        Уайта). Среда ШХ от других сред отличается очень высоким, деся-
 4. ПРОМЫШЛЕННОЕ ПРОИЗВОДСТВО БАВ ИЗ КУЛЬТУ-                            тикратным содержанием мезоинозината. Среди МС и ШХ содер-
            РЫ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ                                          жат железо в хелатированной форме в комплексе с ЭДТА. Это
                                                                        обеспечивает его доступность при рН до 8,0 в течение всего пе-
     В основе промышленного производства БАВ (лекарственный             риода роста культуры, тогда как при отсутствии хелатирующего
субстанций и др.) из культуры клеток растений лежит ряд после-          агента недостаток железа может проявиться очень быстро.
довательных стадий и операций: получение высокопродуктивных                  Компоненты среды для выращивания каллусных и суспензи-
продуцентов, разработка оптимальных условий культивирования             онных культур можно разделить на шесть групп, что обычно отра-
продуцента БАВ с максимальным биосинтезом целевого продукта,            жает порядок приготовления концентрированных растворов:
разработка и внедрение в практику соответствующих методов и                1) основные неорганические питательные вещества (макро-
условий выделения и очистки БАВ, создание готовых препаратов и                 элементы);
контроль качества. Работа на каждом из этих этапов должны про-             2) микроэлементы
водится соответствующими специалистами: биотехнологами, гене-              3) источники железа;
тиками, химиками-технолагами (Чуешов и др., 2002).                         4) органические добавки (витамины);
                                                                           5) источники углерода;
     4.1 Подготовка среды для культивирования продуцента и                 6) регуляторы роста растений.
посевного материала (первая стадия).                                         В реактор с мешалкой с помощью вакуума вносят поочеред-
                                                                        но приготовляемые растворы, соблюдая следующий порядок:

                                                                   39        40


   -   раствор макросолей;                                         ковый холодильник.здесь она охлаждается до 30-35°С (на выходе)
   -   агарированный раствор;                                      и поступает в ферментатор. Непрерывный метод стерилизации
   -   раствор хелата железа;                                      имеет ряд преимуществ перед периодическим методом: возмож-
   -   раствор микроэлементов;                                     ность автоматического регулирования процесса, быстрый и равно-
   -   раствор кальция, нитрата;                                   мерный нагрев среды, обеспечение более полной стерильности
   -   раствор сахара.                                             среды.
      Смеси тщательно перемешивают в течение 5 мин., затем 1-2           Подготовка посевного материала – одна из ответственных
мин ведут вертикальное перемешивание путем барботажа при           операций в цикле биологического методы получения БАВ из куль-
включенной мешалке. Обязательно отбирают контрольные пробы         туры тканей.
для опредления рН среды (рН должно быть в пределах 5,0-6,2;              Культуру ткани (коллекцию культуры) заводы получают из
температура раствора (22 ± 2,5°С).                                 академий и университетов. Каждая культура имеет паспорт с под-
      В промышленных условиях стерилизация питательных сред        робным описанием морфологии, физиологии, характеристики сре-
осуществляется двумя основными методами: периодическим и не-       ды для культивирования и хранения.
прерывным.                                                               Для твердофазного метода культуру ткани выращивают на
      Периодический метод стерилизации применяют при исполь-       агаризованной стерильной питательной среде в колбах вместимо-
зовании небольших объемов среды. Он заключается в том, что         стью 0,25 л в термостатируемом помещении или термостате с тем-
среда, нагретая до определенной температуры (120-125°С) непо-      пературой 27±1°С. на 38-46 сут. Роста ткань материнской культу-
средственно в ферментаторах или в специальных паровых стери-       ры режут ткаим образом, чтобы инокулюм состоял из вертикаль-
лизаторах ГПСД-1700, выдерживается при этой температуре в те-      ного столба (верхний слой, средний и часть нижнего слоя безага-
чение 30-60 мин (в заивисимости от объема среды или от её соста-   ризованной среды). Нельзя допускать воздействия на культуру
ва, после чего охлаждается до 27-30°С).                            дезсредств, бактерицидных ламп, так как это приводит к инактива-
      Непрерывный метод стерилизации целесообразно применять       ции роста. Из материнской культуры пересаживают 7-9 дочерних
при использовании больших объемов среды. Приготовленная сре-       культур и через 38-46 сут. Роста в термостатируемом помещении
да из специального сосуда с помощью насоса подается в стерили-     отбирают колбы с культурами тканей лучших ростовых признаков.
зационную колонну, через которую пропускается острый пар (дав-     Для таких культур характерен быстрый рост, максимальное ис-
ление пара около 5 атм.). Пар подается сверху по внутренней тру-   пользование питательной среды, цвет ткани от светло-желтого до
бе, имеющей щелевидные прорези, благодаря чему пар поступает в     молочного, отсутствие некротических включений.
среду и быстро её нагревает. Среда в колонну подается снизу и            Для глубинного (суспензионного) метода культуру ткани
движется по спирали вокруг внутренней трубы.                       предварительно выращивают на агаризованной стерильной среде в
      Нагретая в колонне до необходимой для стерилизации тем-      пробирках, затем из пробирок высеивают в колбы с жидкой пита-
пературы (около 125°С), среда поступает в специальный аппарат –    тельной средой и проводят две генерации глубинного выращива-
выдерживатель, где она выдерживается при температуре 120-          ния на качалках в течение 38-46 сут. для каждой генерации. Из
125°С. время выдерживания зависит от состава среды и составляет    второй генерации культуры (в колбе) делают посев в небольшой
5-10 мин. Из выдерживателя стерильная среда поступает в змееви-    (10 л) инокулятор, а затем хорошо развивающуюся культуру пере-

                                                         41              42



    
Яндекс цитирования Яндекс.Метрика